崔雨明，侯佩莉，張茂林，李鴻梅，黃 飛，關(guān)振宏＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 人獸共患病研究所，吉林 長春 130062）

A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）是嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物生命健康的病原體之一，其高發(fā)病率和死亡率可對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成很大的影響[1]。IAV可感染包括人、哺乳動(dòng)物、家禽及野生禽類等在內(nèi)的多種宿主，其危害嚴(yán)重，曾引起20世紀(jì)的三次人際間的流感大流行，例如1918年－1919年的大流行中，全世界約有2000萬以上的人死于流感。IAV屬于正黏病毒科，其基因組由8條負(fù)鏈單股RNA節(jié)段組成，其中第1、2、3節(jié)段分別編碼聚合酶蛋白PB2、PB1和PA。

2001年，Chen W 等[2]研究T細(xì)胞表位CD8＋時(shí)發(fā)現(xiàn)了IAV的第11種蛋白質(zhì)——PB1－F2。該蛋白是由聚合酶亞單位PB1基因編碼的，由87個(gè)左右的氨基酸組成。PB1－F2在絕大多數(shù)的IAV中都有發(fā)現(xiàn)，而在B型流感病毒中沒有編碼相似蛋白的基因片段[3]。它在宿主細(xì)胞中的存在時(shí)間非常短，一般在病毒感染后2h開始翻譯，并且在5h達(dá)最大蛋白表達(dá)量[2]。研究發(fā)現(xiàn)PB1－F2主要定位在線粒體表面，但是其在某些病毒感染的細(xì)胞中的胞漿及核內(nèi)都能發(fā)現(xiàn)。定位在線粒體上的PB1－F2能夠與線粒體腺苷酸轉(zhuǎn)位分子3（ANT3）和電壓依賴的陰離子通道1（VDAC1）結(jié)合，改變線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素C而引起線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PB1－F2主要引起免疫細(xì)胞的凋亡，這將導(dǎo)致抗原遞呈和獲得性免疫應(yīng)答的降低，這是其致病性的重要因素[5]。PB1－F2還能直接與PB1相互作用，調(diào)節(jié)聚合酶的活性，導(dǎo)致病毒聚合酶的活性增強(qiáng)，從而增加RNA的積累，保證了病毒的充分復(fù)制[6]。

PB1－F2是流感病毒的一種重要毒力因子，病毒所致的高死亡率很可能與多種流感病毒毒株中都存在的 PB1－F2 蛋白有關(guān)[7－8]。McAuley J L等[9]研究發(fā)現(xiàn)PB1－F2作為一個(gè)新的流感病毒的毒力因子，能促進(jìn)病毒感染后繼發(fā)的細(xì)菌感染。AIV感染所致死亡率的主要原因?qū)嶋H是這些繼發(fā)的細(xì)菌感染。Conenello G M等[10]比較病毒的氨基酸序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，來自1997年香港和1918年西班牙的流感病毒PB1－F2蛋白的66位氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸，這很可能是這兩種病毒株高致死率的一個(gè)因素。

PB1－F2蛋白自被發(fā)現(xiàn)以來就倍受關(guān)注，許多研究都表明該蛋白在流感病毒的侵染過程中起重要作用，但是其影響病毒入侵、復(fù)制和致病作用的分子機(jī)理尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，從人白細(xì)胞文庫中篩選與PB1－F2蛋白相互作用的新宿主蛋白，為進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pcDNA3.0／HA－PB1－F2、大腸埃希菌DH5α為吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒室保存。Matchmaker GAL4Two－h(huán)ybrid System 3酵母雙雜交系統(tǒng)、BD 克隆質(zhì)粒 pGBKT7、AD 克隆質(zhì)粒pACT2、酵母菌株AH109、人工合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng) 基 SD／－Trp／－Leu／－His、SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade、X－α－半乳糖苷酶（X－α－gal）和人白細(xì)胞cDNA文庫均購自Clontech公司；PEG 3350購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，酵母質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；各種限制性內(nèi)切酶、高保真Pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；鮭魚精DNA、醋酸鋰購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母誘餌質(zhì)粒 pGBKT7－PB1－F2 的構(gòu)建根據(jù)GenBank上登錄的流感病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）的PB1－F2的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如下：上游引物（帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）：5′CGGAATTCATGGGACAGGAACAGGATAC 3′；下游引物（帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)）：5′CGGGATCCCTAATACACAATCTGTTTGGG 3′。以pcDNA3.0／HA－PB1－F2 為模板，PCR 擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增條件是95℃5min變性后進(jìn)入循環(huán)，94℃30s，58℃ 40s，72℃ 30min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。然后將pGBKT7載體和PCR產(chǎn)物片段用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒后采用酶切法鑒定，并對(duì)所得候選陽性質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.2.2 誘餌蛋白的自身激活檢測(cè) 采用標(biāo)準(zhǔn)的醋酸鋰法來制備感受態(tài)酵母細(xì)胞AH109，然后按照Clontech公司說明書上的方法將酵母表達(dá)載體誘餌質(zhì)粒pGBKT7－PB1－F2轉(zhuǎn)化到AH109感受態(tài)中，隨機(jī)挑選含pGBKT7－PB1－F2 與 pGBKT7質(zhì)粒的AH109酵母細(xì)胞單克隆，劃線接種于SD／－Trp／－Ade／X－α－Gal，SD／－His／－Trp／X－α－Gal營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)1周，觀察其生長情況，檢測(cè)誘餌蛋白有無自激活作用。將轉(zhuǎn)化pGBKT7－PB1－F2和空載體pGBKT7的酵母細(xì)胞分別在SD／－Trp／Kan（20μg／mL）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h～24h，測(cè)定培養(yǎng)液的A600，進(jìn)行誘餌蛋白的毒性檢測(cè)。

1.2.3 誘餌蛋白表達(dá)的檢測(cè) 分別挑取未轉(zhuǎn)化載體的酵母菌和pGBKT7－PB1－F2陽性的酵母單克隆菌落接到SD／－Trp／Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，用酵母蛋白提取試劑盒提取酵母總蛋白，通過 Western blot驗(yàn)證PB1－F2蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。

1.2.4 酵母共轉(zhuǎn)化法篩選與PB1－F2相互作用的蛋白 按照Clonteck公司Matchmaker System 3說明書進(jìn)行。將白細(xì)胞cDNA文庫和pGBKT7－PB1－F2誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞中，其中文庫質(zhì)粒DNA 100μg、誘餌質(zhì)粒75μg、鮭魚精DNA 0.1mg，混勻后加入9mL無菌PEG／Li－Ac溶液（10%的10×TE，10%的10×LiAc，80%的50%PEG）中，30℃、200r／min振蕩培養(yǎng)45min；加入1mL DMSO，42℃熱激20min，置于冰上2 min，4000r／min離心3min；用15mL的無菌1×TE緩沖液重懸細(xì)胞，涂于四缺平板SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade上，于30℃ 培養(yǎng)3d～7d。同時(shí)在雙缺平板SD／－Trp／－Leu上涂100μL 1∶100稀釋的細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算。

1.2.5 酵母細(xì)胞內(nèi)相互作用的重復(fù)驗(yàn)證 將四缺板上生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行1輪SD／－Leu／－Trp／－His培養(yǎng)皿和 3 輪 SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－α－gal培養(yǎng)皿篩選，排除假陽性。再挑取生長良好、深藍(lán)色的陽性克隆接種于四缺液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取酵母質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α，含氨芐青霉素培養(yǎng)基中篩選克隆，PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒DNA，再重新與重組質(zhì)粒pGBKT7－PB1－F2共同轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－α－gal，不能生長或生長菌落為白斑者作為假陽性克隆。進(jìn)一步采用濾紙法定性檢測(cè)β半乳糖苷酶報(bào)告基因的活性。將濾紙片平鋪于培養(yǎng)皿中劃出不同的區(qū)域，挑取培養(yǎng)皿上長勢(shì)良好的克隆菌落均勻涂在濾紙片的不同區(qū)域，將濾紙片于液氮中反復(fù)凍融幾次，向其中均勻加入10 mL Z buffer／X－Gal，30℃培養(yǎng)并觀察顏色變化，變藍(lán)的為陽性克隆。

1.2.6 基因測(cè)序分析 篩選出假陽性后的文庫質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切后，選擇有插段的樣品送生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序，利用GenBank的數(shù)據(jù)庫資源，運(yùn)用BLAST應(yīng)用程序進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－PB1－F2的構(gòu)建及鑒定

A型流感病毒PB1－F2的全長基因與pGBKT7載體連接，構(gòu)建的pGBKT7－PB1－F2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中，PCR技術(shù)鑒定含重組質(zhì)粒的陽性克??；提取質(zhì)粒并用EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切鑒定（圖1），片段大小相符。測(cè)序分析結(jié)果顯示閱讀框架無誤，表明構(gòu)建誘餌質(zhì)粒成功。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7－PB1－F2的PCR及酶切鑒定Fig.1 Identification of pGBKT7－PB1－F2plasmid by PCR and enzyme digestion

2.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－PB1－F2自激活效應(yīng)檢測(cè)和毒性檢測(cè)

將誘餌蛋白載體pGBKT7－PB1－F2及空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)AH109酵母菌中，隨機(jī)挑選幾個(gè)單克隆菌落涂布營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)皿，30℃培養(yǎng)3d～5d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包含pGBKT7－PB1－F2及空載體pGBKT7的酵母菌株在SD／－Trp／－Ade／－X－α－gal、SD／－Trp／－His／－X－α－gal培養(yǎng)板上都沒有長出菌落，這表明pGBKT7－PB1－F2在該酵母雙雜交系統(tǒng)中無自身激活作用，可以用于文庫篩選。再將上述兩種轉(zhuǎn)化酵母菌分別在SD／－Trp／Kan液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜，觀察發(fā)現(xiàn)pGBKT7－PB1－F2及pGBKT7兩個(gè)菌株生長情況都非常良好，其OD值比較接近，說明誘餌載體pGBKT7－PB1－F2對(duì)酵母細(xì)胞沒有毒性，可以用于酵母雙雜交文庫篩選。

2.3 誘餌質(zhì)粒蛋白在酵母中的表達(dá)

在SD／－Trp／Kan液體培養(yǎng)基中接入含有pGBKT7－PB1－F2誘餌質(zhì)粒和無載體的酵母菌株，30℃培養(yǎng)過夜，收集沉淀用酵母蛋白提取試劑盒提取誘餌質(zhì)粒陽性克隆酵母菌中的總蛋白，用c－Myc抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示在相應(yīng)分子質(zhì)量處可檢測(cè)到特異性條帶，說明含誘餌質(zhì)粒的酵母菌中有PB1－F2蛋白的表達(dá)（圖2）。

2.4 白細(xì)胞文庫中與PB1－F2相互作用蛋白的篩選

利用酵母雙雜交系統(tǒng)以pGBKT7－PB1－F2質(zhì)粒為誘餌蛋白篩選人白細(xì)胞cDNA文庫。篩選出的陽性克隆在SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－a－gal培養(yǎng)皿上反復(fù)篩選3次，四缺培養(yǎng)基劃線篩選結(jié)果如下（圖3），再經(jīng)過β－半乳糖苷酶活性測(cè)定（圖4），以排除假陽性克隆。之后將陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，可以看到不同大小的cDNA片段（圖5）。選擇電泳條帶良好的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，通過測(cè)序分析與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，合并序列完全相同的克隆，并剔除載體的閱讀框與目的基因不同的克隆，最后共獲得8種不同類別的基因（表1），包括各種酶、激酶、受體以及相關(guān)因子。

圖2 Western blot檢測(cè) Gal4BD－PB1－F2融合蛋白在AH109中的表達(dá)Fig.2 Western blot analysis of the Gal4BD－PB1－F2 fusion protein expresed in AHl09

圖3 四缺培養(yǎng)基篩選陽性克隆Fig.3 Screening of positive clones using QDO plates

圖4 β－半乳糖苷酶活性測(cè)定Fig.4 Detection ofβ－galactosidase activity

圖5 獵物質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.5 Identification of prey clones by enzyme digestion

表1 以PB1－F2為誘餌蛋白篩選白細(xì)胞文庫獲得的陽性克隆的BLAST結(jié)果Table1 The BLAST results of positive clones obtained from the screening of leukocyte cDNA library using PB1－F2as bait

3 討論

PB1－F2是最近發(fā)現(xiàn)的AIV的一種重要毒力因子，越來越多的證據(jù)表明，這種蛋白具有多種生物學(xué)功能，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)病毒聚合酶的活性，這些特性表現(xiàn)出一定程度的毒株和宿主特異性[11]。但是到目前為止，PB1－F2蛋白在病毒變異、復(fù)制和致病機(jī)制方面的確切機(jī)制還不清楚，因此研究該蛋白與宿主蛋白的相互作用，是研究蛋白分子作用機(jī)制的重要方面。

作為研究蛋白質(zhì)相互作用的一種強(qiáng)有力的工具，酵母雙雜交技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[12－14]。我們采用PB1－F2 基因全長作為誘餌進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合物篩選，共篩選出8種靶蛋白，主要包括酶、激酶、受體以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子。表明PB1－F2在細(xì)胞內(nèi)可以與多種蛋白相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。在這8個(gè)候選PB1－F2相互作用的蛋白中，鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G蛋白）是一組具有GTP結(jié)合、水解活性的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜受體和效應(yīng)蛋白之間的信息傳遞過程中起中介作用，是細(xì)胞內(nèi)一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。G蛋白由3條蛋白鏈組成，按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小排列為Gα、Gβ和 Gγ，每一個(gè)亞單位也由多種亞型組成[15－16]。鳥嘌呤核甘酸結(jié)合蛋白β多肽2（GNB2）是G蛋白β亞單位的成員，是一種WD40結(jié)構(gòu)重復(fù)的多功能蛋白，最近發(fā)現(xiàn)其在線粒體融合等方面發(fā)揮重要的作用[17－18]。研究表明G蛋白通過CCR5和CXCR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在HIV復(fù)制過程中是非常重要的，所以深入探索G蛋白信號(hào)對(duì)病毒復(fù)制和疾病進(jìn)程的作用是很重要的工作[19]。雖然目前關(guān)于GNB2的研究報(bào)道較多，但其在流感病毒感染方面還未見報(bào)道。

本研究中，我們篩選出與PB1－F2蛋白相互作用的8種靶蛋白，通過分析這幾種蛋白已知的生物學(xué)功能及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為探索PB1－F2蛋白功能和作用機(jī)理提供了新的方向，同時(shí)對(duì)流感病毒的防控具有極為重要的意義。PB1－F2與這些蛋白相互作用的生物學(xué)意義值得深入研究。

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