鄭昆 馬秦嶺

(武警河南總隊衛(wèi)生處 鄭州 450001)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension)是一種常見心血管疾病,其發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素有關(guān),但具體發(fā)生機制尚不清楚。內(nèi)源性一氧化氮(nitric oxide,NO)是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的作用下產(chǎn)生的,是一種化學性質(zhì)活躍的氣體自由基,亦是一種重要的生物信號分子。在心血管系統(tǒng)中,NO具有擴張血管,抑制血小板黏附和聚集,抑制血管平滑肌細胞和淋巴細胞增殖,以及影響心臟舒縮周期和收縮力等功效。研究表明,NO與高血壓發(fā)生密切相關(guān)[1]。Kleinbongard等[2]在紅細胞漿膜上發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),表明紅細胞也是心血管系統(tǒng)內(nèi)NO的主要來源之一。本研究擬觀察原發(fā)性高血壓患者紅細胞eNOS蛋白表達量和活性,以及血漿中NO含量的變化,以探討紅細胞eNOS-NO系統(tǒng)在高血壓發(fā)生中的可能作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象分為對照組和高血壓組。對照組:我院體檢正常,且無心血管疾病家族史的老人,其中男11人,女9人,年齡(59.6±7.7)歲。高血壓組:高血壓診斷標準按1999年WHO高血壓指南定義的標準確診。選擇原發(fā)性高血壓患者20例,其中男13例,女7例,年齡（62.3±8.8）歲。

1.2 血樣采集及紅細胞制備

實驗前48h內(nèi)受試者均未服任何藥物。受試者于清晨(6∶30～7:30)靜臥15min,空腹,肘靜脈采血5mL。所有血液樣品均加入38g/L枸櫞酸鈉(體積比1∶9)抗凝,1400g離心10min,去上清。加入4倍體積Hank’s平衡鹽溶液(MHBSS)中反復離心3遍,清洗后取紅細胞懸浮于等體積Hank’s平衡鹽溶液中待測。

表1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較(±s)

表1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較(±s)

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

血漿NO2-/NO3-含量(μmol/L)紅細胞eNOS活性(U/mg)羥自由基(KU/L)對照組 88.37±5.71 39.82±4.15 192.15±22.31高血壓組 (65.30±6.95)* (25.64±4.51)** (285.40±34.46)**

1.3 血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性測定

依照試劑盒(南京建成生物公司)說明,紫外分光光度計測量紅細胞eNOS活性,自動生化分析儀測定血漿NO2-/NO3-含量和羥自由基含量。

1.4 Western blot法測定紅細胞eNOS蛋白表達

制備紅細胞組織勻漿,考馬斯亮藍法測定蛋白含量。蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗(Santacruz公司)孵育過夜,HRP標記二抗(TBD公司)孵育1h,ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件掃描各條帶灰度值,以對照組運動前條帶為100%,其它各條帶與其比值,即其相對表達量(%)。Actin作為內(nèi)參蛋白。

1.5 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進行處理,結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示,各組比較采用單因素方差分析,P<0.05為顯著性水平,P<0.01為非常顯著水平。

2 研究結(jié)果

2.1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較

高血壓組NO2-/NO3-含量和紅細胞eNOS活性均低于正常對照組,羥自由基含量高于正常對照組,且差異均具有顯著性意義,分別為P<0.05和P<0.01,見表1。

2.2 各組紅細胞eNOS蛋白表達水平變化

如圖1所示,高血壓組紅細胞eNOS蛋白表達水平相對于對照組降低了26%,差異具有顯著性意義(P<0.01)

3 討論

圖1 各組紅細胞eNOS蛋白表達水平變化

在心血管系統(tǒng)中,NO自由擴散到鄰近的血管平滑肌細胞內(nèi),與細胞膜上的鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合,使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP,后者促進Ca2+內(nèi)流,從而引起血管平滑肌舒張。NO的基礎合成對血管張力和血壓的調(diào)節(jié)具有非常重要的作用,抑制NO的合成可使健康人的血壓升高。此外,NO亦可通過cGMP途徑水平增高抑制血小板的聚集,從而抑制動脈內(nèi)血栓形成及冠心病的發(fā)生[3]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)高血壓患者血漿NO2-/NO3-含量顯著低于對照組。其他研究亦發(fā)現(xiàn),自發(fā)性高血壓大鼠及高血壓患者血清NO水平下降,血管舒張功能障礙[4]。這表明NO與高血壓的形成和發(fā)展有著密切的關(guān)系。高血壓患者血漿NO含量降低可能與降解增加有關(guān)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn),高血壓組血漿羥自由基水平明顯高于對照組。研究表明,高血壓患者中性粒細胞及單核細胞內(nèi)的氧自由基活躍增強,而抗氧化酶活性減弱,氧自由基可與NO結(jié)合成ONOO-而直接滅活NO,使其生物活性喪失[5]。Janega等[6]研究表明,高血壓大鼠給予外源性SOD和過氧化氫酶補充,可增加NO水平,從而保護內(nèi)皮細胞功能并松弛血管平滑肌。

高血壓患者NO水平降低除了與破壞增加有關(guān),還與其生成減少有關(guān)。NOS是調(diào)節(jié)NO合成的關(guān)鍵酶,已確認有3種同工酶:神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導型(iNOS),它們分布的部位、生物效應及調(diào)控機制各不相同[7]。研究表明,心血管系統(tǒng)NO主要是由血管內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)催化合成。研究證實eNOS亦存在于紅細胞漿膜,且在正常情況下參與循環(huán)系統(tǒng)約30%的NO供應[2]。本研究中,高血壓組紅細胞eNOS表達量降低了26%,其活性亦降低了36%。Fischer等在體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn),高血流切應力可顯著激活紅細胞中eNOS,但高頻反復的高血流切應力可抑制eNOS的活化[8]。此外,Pistea等[9]報道,高血壓患者中的高血流切應力使紅細胞膜蛋白質(zhì)的脫失與降解明顯增加,這可能與本研究中高血壓組紅細胞eNOS表達量降低有關(guān)。高血壓患者外周血管阻力增大,因而血流切應力明顯升高,從而損傷紅細胞eNOS-NO合成系統(tǒng)的生物學作用。NO產(chǎn)生減少進一步抑制血管舒張,從而繼續(xù)提高血流切應力,破壞紅細胞、血小板、內(nèi)皮細胞內(nèi)的NO合成系統(tǒng),從而形成惡性循環(huán),這可能是高血壓形成的一個機制。

本研究首次觀察了原發(fā)性高血壓患者紅細胞eNOS-NO合成系統(tǒng)變化規(guī)律,結(jié)果表明,高血壓患者血漿NO減少可能與氧自由基破壞增加以及紅細胞eNOS-NO合成系統(tǒng)受損有關(guān),提示外源性補充抗氧化劑及誘導紅細胞eNOS表達可能有益于高血壓的治療。

[1]Gkaliagkousi,E,S.Douma,C.Zamboulis,et al.Nitric oxide dysfunction in vascular endothelium and platelets:role in essential hypertension[J].J Hypertens,2009,27:2310～2320.

[2]Kleinbongard,P,R.Schulz,T.Rassaf,et al.Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase[J].Blood,2006,107:2943～2951.

[3]Pilon,M,R.Wu,J.E.Huot-Marchand,et al.Effect of chronic inhibition of nitric oxide on hypertension,insulin resistance,and cardio-vascular remodeling in glucose-fed rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2009,53:405～413.

[4]Pechanova,O,L.Jendekova,S.Vrankova.Effect of chronic apocynin treatment on nitric oxide and reactive oxygen species production in borderline and spontaneous hypertension[J].Pharmacol Rep,2009,61:116～122.

[5]Yoshioka,H,S.Asai,M.Yoshioka,et al.Molecular mechanisms of generation for nitric oxide and reactive oxygen species,and role of the radical burst in plant immunity[J].Mol Cells,2009,47:18～26.

[6]Janega,P,S.Kojsova,L.Jendekova,et al.Indapamide-induced prevention of myocardial fibrosis in spontaneous hypertension rats is not nitric oxide-related[J].Physiol Res,2007,56:825～828.

[7]Jin,Q,T.Z.Zhang,W.M.Chen,et al.Preventive effect of endothelial nitric oxide synthase gene transfer on chronic hypoxic pulmonary hypertension in rats[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2009,21:222～225.

[8]Fischer,U.MR.Schindler,K.Brixius,et al.Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes[J].Ann Thorac Surg,2007,84:2000～2003.

[9]Pistea,A.,E.N.Bakker,J.A.Spaan,et al.Small artery remodeling and erythrocyte deformability in L-NAME-induced hypertension:role of transglutaminases[J].J Vasc Res,2008,45:10～18.