羅向陽(yáng)，張振武，曹振杰，王 偉

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科鄭州450052

尿道下裂是一種常見(jiàn)的兒童先天性尿路及外生殖器畸形，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量，其發(fā)病率為1/300～1/200，且近年來(lái)呈逐年增加的趨勢(shì)［1］。研究［2］表明尿道下裂的發(fā)生與基因突變、細(xì)胞間異常信息傳遞及環(huán)境因素等有關(guān)。環(huán)境中廣泛存在的雌激素和抗雄激素類物質(zhì)的污染引起陰莖上皮細(xì)胞異常分化是其發(fā)病的主要原因，也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)［3］。Hedgehog信號(hào)通路是維持哺乳動(dòng)物胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)之一，其家族主要成員Sonic hedgehog(Shh)與其受體Ptch1結(jié)合參與許多器官結(jié)構(gòu)如神經(jīng)管、肢體、肺、皮膚、毛發(fā)以及外生殖器等組織形態(tài)的發(fā)生，其異常表達(dá)可致多個(gè)臟器的畸形，而其異常激活則與多種腫瘤形成有關(guān)［3］。作者的前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)尿道下裂患兒包皮組織及抗雄性物質(zhì)氟他胺(flutamide，F(xiàn)lu)暴露后的胎鼠及新生大鼠陰莖組織p53基因表達(dá)均上調(diào)，陰莖組織上皮細(xì)胞增殖受阻。該研究中作者進(jìn)一步觀察Flu暴露對(duì)胎鼠及新生大鼠陰莖組織Shh及其受體Ptch1表達(dá)的影響，探討其與尿道下裂發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。隨機(jī)引物Oligo dT12-18、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)及Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Shh和Ptch1及β-actin引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。Flu由上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):H10950220)。

1.2 動(dòng)物模型的制備及分組 選擇河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的定期受孕的健康SD雌性妊娠大鼠36只，參閱McIntyre等［6］的實(shí)驗(yàn)方法制作尿道下裂動(dòng)物模型:隨機(jī)分為Flu組(n=18)和對(duì)照組(n=18)，于孕12～16 d分別腹部皮下注射Flu或生理鹽水100 mg/(kg·d)，2組動(dòng)物均于胚胎19 d及出生后1、4、7 d各隨機(jī)取8只子鼠，切取陰莖組織，液氮速凍后存于－80℃冰箱備用。

1.3 Shh和Ptch1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)采用Trizol試劑提取陰莖組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系:模板cDNA 0.2～0.4 μL，10 × PCR buffer(含 MgCl2)1.5 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，等離子水 11 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，72℃延伸1 min，不同溫度(Shh為54℃，Ptch1為48℃)退火50 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。然后用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min。采用MUVB220凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)Ultralum公司)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行分析，以目的基因Shh和Ptch1擴(kuò)增帶與內(nèi)參β-actin擴(kuò)增帶灰度值的比值作為其mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間Shh和Ptch1 mRNA表達(dá)水平的比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn);同一時(shí)間點(diǎn)2組間Shh和Ptch1 mRNA表達(dá)水平的比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠陰莖組織中Shh mRNA的表達(dá) 對(duì)照組Shh mRNA的表達(dá)在孕19 d～出生后4 d隨鼠齡增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，此后減弱。Flu組在孕19 d～出生后7 d隨鼠齡增加逐漸增強(qiáng)，并且Flu組在孕19 d及出生后1和4 d，Shh mRNA的表達(dá)水平均低于對(duì)照組。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 2組大鼠陰莖組織Shh基因的表達(dá)情況

表2 2組胎鼠及新生大鼠陰莖組織Shh mRNA的表達(dá)比較(n=8)

2.22 組大鼠陰莖組織中Ptch1 mRNA的表達(dá) 對(duì)照組Ptch1 mRNA的表達(dá)在孕19 d～出生后7 d隨鼠齡增加無(wú)明顯變化，而Flu組有增強(qiáng)的趨勢(shì)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 2組大鼠陰莖組織Ptch1基因的表達(dá)情況

3 討論

人類正常外生殖器的發(fā)育起始于胚胎發(fā)育的第6周，尿生殖竇腹側(cè)開(kāi)始出現(xiàn)突起，形成尿生殖嵴，不久生殖嵴的兩端融合，呈結(jié)節(jié)樣隆起形成生殖結(jié)節(jié)，兩側(cè)的隆起為尿道襞。至胚胎7～9周，在雄性激素作用下，來(lái)自內(nèi)胚層的尿生殖竇(即尿道板)被尿道襞引導(dǎo)沿腹側(cè)中線由背側(cè)向腹側(cè)不斷延伸，從后向前逐漸融合形成完整尿道。各種原因引起的尿道板的融合障礙，均可導(dǎo)致尿道下裂［2，7］。

環(huán)境中廣泛存在的雌激素和抗雄激素類物質(zhì)如殺蟲劑、天然植物激素、塑料制品的副產(chǎn)品、藥物等的污染可能是造成尿道下裂發(fā)病率上升的原因，它們可通過(guò)不同的分子機(jī)制干擾雄激素的作用，影響男性外生殖器的發(fā)育，導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生［8-9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)大鼠胚胎期12～16 d相當(dāng)于人類胚胎8～16周，因此作者參閱 McIntyre等［6］的實(shí)驗(yàn)方法，在大鼠孕12～16 d給予Flu干預(yù)，探討宮內(nèi)抗雄性物質(zhì)干預(yù)對(duì)Shh及其受體Ptch1表達(dá)的影響。

Shh及其受體Ptch1是調(diào)控胚胎期細(xì)胞增殖分化的重要因子，其作用主要是促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為尿道襞上皮細(xì)胞［11］。此外，Shh及其受體Ptch1主要通過(guò)阻斷細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化及G2向M期轉(zhuǎn)化，調(diào)控細(xì)胞增殖分化［12-13］。該研究結(jié)果顯示Flu干預(yù)后Shh mRNA的表達(dá)在孕19 d和出生后1 d和4 d較對(duì)照組顯著減弱，其受體Ptch1 mRNA的表達(dá)在孕19 d和出生后1 d較對(duì)照組減弱，但2指標(biāo)隨出生時(shí)間的增加有升高的趨勢(shì)。以上結(jié)果提示宮內(nèi)抗雄性物質(zhì)干預(yù)在胚胎發(fā)育期及出生早期可能通過(guò)下調(diào)Shh基因及其受體Ptch1的表達(dá)，使尿道襞間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化異常，引起尿生殖結(jié)節(jié)的表面和尿道襞中間的位置融合障礙，尿道開(kāi)口的位置異常;在出生后期Shh表達(dá)增強(qiáng)則會(huì)使尿道形成后期尿道襞上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，使尿道板腔化受阻，上皮細(xì)胞殘留而阻礙兩側(cè)尿道襞吻合，進(jìn)而影響尿道縫形成，最終可能導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生。

總之，宮內(nèi)抗雄性物質(zhì)暴露可調(diào)控陰莖組織Shh及其受體Ptch1的表達(dá)，引起尿道襞間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化異常，尿道板腔化受阻，可能與尿道下裂畸形的發(fā)生有關(guān)。

［1］Giwercman A，Giwercman YL.Environmental factors and testicular function［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011，25(2):391

［2］Kalfa N，Philibert P，Baskin LS，et al.Hypospadias:interactions between environment and genetics［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，335(2):89

［3］Kalfa N，Sultan C，Baskin LS.Hypospadias:etiology and current research［J］.Urol Clin North Am，2010，37(2):159

［4］羅向陽(yáng)，王偉.宮內(nèi)抗雄性物質(zhì)暴露對(duì)胎鼠及新生大鼠陰莖組織p53和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26(14):1137

［5］羅向陽(yáng)，王偉.尿道下裂患兒包皮組織p53和p21waf/cip1 mRNA 的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(6):898

［6］McIntyre BS，Barlow NJ，F(xiàn)oster PM.Androgen-mediated development in male rat offspring exposed to flutamide in utero:permanence and carrelation of early postnatal changes in anogenital distance and nipple retemion with malformations in androgen-dependent tissues［J］.Toxicol Sci，2001，62(2):236

［7］Main KM，Skakkebaek NE，Virtanen HE，et al.Genital anomalies in boys and the environment［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metal，2010，24(2):279

［8］Jakobovits A，Jakobovits A.Intrauterine development，functions and diseases of male reproductive organs［J］.Orv Hetil，2010，151(39):1573

［9］Thorup J，McLachlan R，Cortes D，et al.What is new in cryptorchidism and hypospadias--a critical review on the testicular dysgenesis hypothesis［J］.J Pediatr Surg，2010，45(10):2074

［10］Kim TS，Jung KK，Kim SS，et al.Effects of in utero exposure to DI(n-Butyl)phthalate on development of male reproductive tracts in Sprague-Dawley rats［J］.J Toxicol Environ Health A，2010，73(21/22):1544

［11］Angeloni NL，Bond CW，Monsivais D，et al.The role of hedgehog-interacting protein in maintaining cavernous nerve integrity and adult penile morphology［J］.J Sex Med，2009，6(9):2480

［12］Parkin CA，Allen CE，Ingham PW.Hedgehog signalling is required for cloacal development in the zebrafish embryo［J］.Int J Dev Biol，2009，53(1):45

［13］Podlasek CA.Sonic hedgehog，apoptosis，and the penis［J］.J Sex Med，2009，6(Suppl 3):334