王 昂，丁煥中，高 艷，高國峰，曾振靈

(1華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣東廣州510642;2南京仕必得生物技術有限公司，江蘇南京211106)

鹽酸特比萘芬為第2代烯丙胺類衍生物，通過特異性的抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性而減少麥角固醇的合成，從而引起菌體細胞壁破裂而起到殺菌作用，具有最小抑菌濃度低、與血漿蛋白結合率高(99%)、體內分布廣、半衰期長、耐受性好、不良反應少等特點［1］.自特比萘芬在美國上市以來，銷量一直穩(wěn)居前列，成為抗淺部真菌的首選藥物，雖然它還未被批準應用于寵物，但國內外獸醫(yī)經(jīng)常用其治療犬和貓的真菌感染性皮膚病，并具有顯著的療效［2-5］.本試驗旨在探討比格犬口服鹽酸特比萘芬膠囊的藥物動力學(簡稱藥動學)特征及生物利用度，為其臨床應用提供給藥方案，提高用藥的有效性和安全性.

1 材料與方法

1.1 試驗藥品與試劑

鹽酸特比萘芬原料藥(質量分數(shù)為99.5%)，批號1003002，浙江東亞藥業(yè)有限公司提供;鹽酸特比萘芬對照品(質量分數(shù)為100%)，批號100563—200301，為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;鹽酸特比萘芬膠囊(400 mg/粒，含特比萘芬150 mg)，批號201008121，為南京仕必得生物技術有限公司產(chǎn)品.磷酸、硫酸、三乙胺、異丙醇、正己烷均為分析級，乙腈為色譜級.

1.2 主要儀器

Acquity UPLC system液相色譜儀，為Waters公司產(chǎn)品;電子分析天平(AUX120型，SHIMADZU)，酸度計(PHS-2C型)為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;可調微量移液器(Eppendorfer research型，20～200 μL、10 ～ 1 000 μL).

1.3 試驗動物和給藥

8只健康比格犬，雌雄各半，2～3歲齡，體質量(14.85±1.37)kg，由廣東省醫(yī)藥研究總院提供.采用單劑量雙周期交叉試驗設計，8只健康比格犬隨機分為2組:一組靜脈注射自制鹽酸特比萘芬溶液，另一組口服鹽酸特比萘芬膠囊，給藥劑量均為10 mg·kg-1，1周后交叉替換另一種給藥途徑.試驗前12 h及給藥后4 h期間禁食，僅自由飲水.

1.4 血樣采集

給藥前(0 h)采空白血，給藥后于0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h 前肢靜脈采血約2 mL，置于含肝素的離心管中，混勻，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，-20℃條件保存至測定.

1.5 血藥質量濃度測定及方法學考察

1.5.1 血漿樣品的前處理 取犬血漿0.5 mL，置于10 mL離心管中，加入4 mL正己烷，200 r·min-1水平震蕩20 min后5 000 r·min-1離心10 min，轉移正己烷層至新的離心管中，重復提取1次，合并2次正己烷層，加入1 mL 0.5 mol·L-1的 硫酸-異丙醇溶液(體積比為85∶15)，震蕩 15 min，5 000 r·min-1離心5 min，棄去上層正己烷，取下層硫酸-異丙醇溶液進行HPLC檢測，進樣量為20 μL.

1.5.2 色譜條件 色譜柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈 -0.1% 三乙胺(體積分數(shù)，磷酸調節(jié)pH至3.5)(體積比為50∶50);檢測波長224 nm;柱溫24℃ ;流速 1.0 mL·min-1;進樣量 20 μL.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Winnolin 5.2.1程序，利用非房室模型分析血藥質量濃度-時間數(shù)據(jù)，獲得特比萘芬單劑量經(jīng)靜注和內服給藥在比格犬體內的藥動學參數(shù)與生物利用度.

2 結果與分析

2.1 方法學研究

在選定的色譜條件下，測定血漿中的特比萘芬準確性高、分離度好、峰形良好、無干擾峰出現(xiàn)，特比萘芬的保留時間為10 min，特比萘芬在血漿中的色譜圖見圖1～3.

圖1 比格犬空白血漿色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank plasma of beagle dogs

圖2 比格犬空白血漿添加特比萘芬(0.5 μg·mL-1)色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank plasma added with terbinafine(0.5 μg·mL-1)

圖3 受試比格犬口服特比萘芬膠囊后45 min(0.25 μg·mL-1)的色譜圖Fig.3 Chromatogram of plasma at 45 min(0.25 μg·mL-1)after oral administration in beagle dogs

2.1.1 標準曲線的制備 取空白血漿置于10 mL的離心管中，加入鹽酸特比萘芬標準液適量制得血漿中藥物質量濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 g·mL-1.按“1.5.1”方法操作，并進行色譜分析.以特比萘芬標準對照品的峰面積(y)對血藥質量濃度(x)進行線性回歸，得血漿標準曲線方程為:y=124 516x+248.5，r2=0.999 8，表明本試驗條件下特比萘芬在0.05～10.00 μg·mL-1范圍內線性關系良好，血漿中特比萘芬的檢測限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)分別為 0.03和 0.05 μg·mL-1.

2.1.2 絕對回收率和精密度的測定 在空白血漿中加入特比萘芬標準液適量，配制成低、中、高(0.1、0.5、8.0 μg·mL-1)3 個質量濃度的特比萘芬血漿樣品，按“1.5.1”中血漿樣品的處理操作，進行高效液相色譜測定，每個質量濃度做5個重復，共3批.結果表明，3個添加質量濃度的絕對回收率均在78.76% ～80.67%范圍內，批內變異系數(shù)在3.15% ～4.25%之間，批間變異系數(shù)在3.37% ～4.63%之間.

2.2 藥動學參數(shù)分析

采用Winnolin 5.2.1程序利用非房室模型分析血藥質量濃度(C)-時間數(shù)據(jù)得到比格犬靜注和口服特比萘芬的平均藥時曲線圖見圖4，主要藥動學參數(shù)見表1.

圖4 比格犬靜注(10 mg·kg-1)和口服(10 mg·kg-1)特比萘芬的血漿質量濃度(C)與時間曲線(n=8)Fig.4 Plasma concentration-time curves of terbinafine after intravenous(10 mg·kg-1)and oral(10 mg·kg-1)administration in beagle dogs(n=8)

表1 比格犬靜注、口服特比萘芬后的主要藥動學參數(shù)(n=8)1)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters determined following intravenous(10 mg/kg)and oral(10 mg/kg)administration terbinafine in beagle dogs(n=8)

3 討論與結論

本研究采用 Denou?l等［6］所采用的提取方法，并在此基礎上改為正己烷提取2次，處理后的血漿樣品無雜質干擾，提高了特比萘芬的回收率，靈敏度與特異性均較高，通過對血漿或組織樣本的HPLC測定方法精密度、回收率的測定，說明本法具有專屬性、準確性、靈敏度高的特點，適合特比萘芬生物樣品含量的測定.

本研究報道了比格犬靜注特比萘芬后的藥動學特征及口服給藥的絕對生物利用度，血藥質量濃度-時間數(shù)據(jù)表明，比格犬靜注特比萘芬后，采用非房室模型分析，其Vss=(2.55±0.89)L·kg-1，t1/2=(3.02±1.70)h，表明其在比格犬體內分布廣泛，消除快，口服鹽酸特比萘芬膠囊后，Vd/F=(35.17±6.58)L·kg-1，t1/2=(1.69±0.74)h，表觀分布容積與國外報道相一致，但是其消除半衰期要遠遠短于鹽酸特比萘芬片劑的研究報道結果(8～16 h)［1，7-9］，這可能與藥物的不同劑型有關，可能片劑在體內有緩釋效果，而膠囊劑型則瞬間崩解，不具有緩釋作用.

比格犬口服鹽酸特比萘芬膠囊的生物利用度僅為(12.54±3.43)%，這可能與該藥物口服具有首過效應有關［9-10］.雖然特比萘芬的生物利用度很低，但是已有文獻表明它具有較強的脂溶性，能夠廣泛分布于毛發(fā)，皮膚，角質層和甲等［11-12］.

目前關于抗真菌藥物療效的藥動學參數(shù)(t＞MIC，AUC/MIC或Cmax/MIC)還并沒有建立，而且這些參數(shù)是否能用于抗真菌藥物還并未得知，因此我們還不知道特比萘芬的殺菌機制是濃度依賴型還是時間依賴型.由于特比萘芬在人、犬和兔子中的血漿蛋白結合率大于99%［1］，而對于血漿中游離濃度小于20%的藥物而言，組織或細胞中的濃度更適合用來進行藥物療效和劑量的推測［13］.對于像特比萘芬這種對組織親和性很強的藥物，在感染部位的藥物濃度要比血漿中的濃度顯得更有意義，因此進行特比萘芬在犬體內的多次給藥的藥動學研究以及在組織部位的濃度非常有必要.

本文試驗所用的犬為比格犬，體外研究表明，比格犬純化的肝微粒體對異丙酚的代謝要快于灰犬的肝微粒體［13-15］，而灰犬與雜種犬并沒有表現(xiàn)出代謝速度的不同，這說明比格犬能夠較快地代謝異丙酚.安替比林為進行藥物代謝的細胞P450酶的探針底物，也是評價藥物分布到總體液的程度的一個標志物.KuKanich等［16］進行了安替比林在比格犬和灰犬體內的比較藥動學，結果表明，比格犬對安替比林的CL為 13.42 mL·min-1·kg-1，而灰犬為 8.33 mL·min-1·kg-1;Vd在 比 格 犬 體 內 為 613 mL·kg-1，在灰犬體內為760 mL·kg-1;比格犬對安替比林的t1/2為0.55 h，灰犬為1.09 h.安替比林在雜種犬的CL為9.1 mL·min-1·kg-1，Vd為640 mL·kg-1，t1/2β為 1.13 h［17］.安替比林在雜種的 CL和t1/2β與灰犬相似，而與比格犬則明顯不同.安替比林在 浣 熊 犬 的 CL、Vd和 t1/2β分 別 為:6.2 mL·min-1·kg-1、668 mL·kg-1和 1.24 h［18］，由此看來，比格犬對由細胞色素P450氧化酶介導的大多數(shù)藥物的代謝要不同于其他犬種.

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