李 鵬 遲德富 宇 佳 李曉燦 關(guān)樺楠 張 喆 王 丹

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

楊扇舟蛾(Clostera anachoretaFabricius)又名楊天社蛾，白楊天社蛾，屬鱗翅目舟蛾科，扇舟蛾屬，主要寄主是楊樹(Populusspp.)和旱柳(Salix matsudanaKodiz.)，春夏之間，幼蟲為害［1］。幼蟲取食楊樹、柳樹的葉片，常將樹葉全部吃光，嚴(yán)重影響樹木生長(zhǎng)。由于幼蟲繁殖快、數(shù)量多、分布廣，大發(fā)生時(shí)極易成災(zāi)，為我國(guó)的重要林業(yè)害蟲之一［2］。對(duì)楊扇舟蛾的研究多集中在生物生態(tài)學(xué)，化學(xué)防治和天敵防治等方面，但目前探索出的防治方法都存在不同程度的不足，因此，尋求新型、有效、簡(jiǎn)便的防治方法以代替化學(xué)農(nóng)藥等的使用，成為亟待解決的問題。本研究通過觸角電位生理反應(yīng)并結(jié)合“Y”型嗅覺儀的行為生測(cè)，旨在篩選出對(duì)楊扇舟蛾具有活性的適宜引誘劑、驅(qū)避劑，并確定其使用濃度。為楊扇舟蛾的監(jiān)測(cè)、防治提供科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)新型生物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

2011年6月從哈爾濱市阿城區(qū)采集楊扇舟蛾幼蟲，置于室外養(yǎng)蟲籠中，每日添加新鮮楊樹枝葉喂養(yǎng)，成蟲羽化后，每日8:00、14:00采集。

1.2 供試化合物及其配制

供試揮發(fā)性氣味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化合物的名稱、純度和來源見表1。用二氯甲烷作溶劑，分別將每種揮發(fā)性化合物配成1 mol/L(精油類稀釋100倍)的溶液，作為EAG反應(yīng)的最大濃度。在使用時(shí)分別用二氯甲烷將其稀釋成 10－1、10－2、10－3、10－4mol/L(精油稀釋1 000、10 000、100 000 倍)。

表1 供試化合物的純度和來源

1.3 觸角電位測(cè)定

以1 mol/L揮發(fā)性化合物或稀釋100倍的精油為測(cè)定觸角電位反應(yīng)(EAG)的最大測(cè)試濃度，以二氯甲烷為對(duì)照，在這個(gè)濃度下EAG反應(yīng)值顯著高于對(duì)照(P＜0.05)的揮發(fā)物，再稀釋成 1、10－1、10－2、10－3、10－4mol/L進(jìn)行進(jìn)一步的EAG測(cè)試。最后將EAG反應(yīng)值明顯高于對(duì)照(P＜0.05)的揮發(fā)物，再分別稀釋成不同濃度，在“Y”型嗅覺儀中進(jìn)行行為生測(cè)［3］。

觸角電位儀產(chǎn)自荷蘭Syntech公司，測(cè)定所需軟件也由該公司提供。測(cè)定方法參照杜永均等［4］、方宇凌等［5］。取昆蟲成蟲，先使之饑餓12 h，再用眼科手術(shù)剪將其1根觸角自基部剪下，用單面刀片切去觸角末端一小節(jié)，然后用導(dǎo)電膠固定在金屬電極上，插入EAG探針;調(diào)整氣味管使之與觸角相距1 cm。用微量取樣器抽取10 μL揮發(fā)物，均勻地滴在2 cm×0.5 cm的濾紙條上，放入10 cm長(zhǎng)的樣品管中，樣品管末端連接氣體刺激控制裝置。待顯示器上的基線穩(wěn)定后給予刺激，刺激氣流流速、持續(xù)氣流均設(shè)定為400 mL/min。每次刺激時(shí)間為0.5 s，間隔為60 s。樣品的測(cè)試順序?yàn)殡S機(jī)排列，但在測(cè)試濃度效應(yīng)時(shí)為了減少高濃度強(qiáng)烈刺激引起的嗅覺適應(yīng)對(duì)后續(xù)刺激的影響，測(cè)試順序按從低濃度到高濃度進(jìn)行。測(cè)定各種化合物時(shí)，每個(gè)濃度同個(gè)觸角測(cè)定3次。

1.4 “Y”型嗅覺儀生物測(cè)定

“Y”型嗅覺儀主臂長(zhǎng)24 cm，兩側(cè)臂長(zhǎng)26 cm，側(cè)臂間夾角60°，主臂和側(cè)臂內(nèi)徑均4 cm。兩臂分別與味源瓶和對(duì)照瓶相連，在氣流進(jìn)入味源瓶之前，先經(jīng)過一個(gè)活性炭過濾器和一個(gè)蒸餾水瓶，以凈化空氣并增加空氣濕度。不同濃度刺激樣品由二氯甲烷配制而成。將10 μL刺激樣品滴加在2 cm×2 cm的濾紙條上，放入味源瓶中，將含有相同體積蒸餾水的濾紙條放入對(duì)照瓶中。以滴加二氯甲烷的濾紙條作為對(duì)照。測(cè)試前將試蟲置于養(yǎng)蟲籠中饑餓12 h。試驗(yàn)前將“Y”型嗅覺儀各部件連接好，放在空氣潔凈生測(cè)室內(nèi)。楊扇舟蛾生測(cè)選擇在遮光的房間中，僅有紅燈照明的環(huán)境下進(jìn)行。開啟大氣采樣儀，調(diào)節(jié)兩臂空氣流量均為1 mL/min，通氣10 min，保證測(cè)試時(shí)“Y”型管內(nèi)空氣清潔［6－8］。

生測(cè)時(shí)將試蟲由“Y”型管主臂管口引入，試蟲逆氣流運(yùn)動(dòng)，待其爬過主臂管口2 cm后開始計(jì)時(shí)。試蟲在“Y”型管分叉處作出選擇，取向不同的側(cè)臂。每組測(cè)試5頭，待前一頭前行2 cm后再放入另一頭。觀察成蟲的行為反應(yīng)。5 min內(nèi)進(jìn)入某一臂，定為對(duì)這一側(cè)有趨性，進(jìn)入與味源瓶相連接的一臂記作該試蟲對(duì)這種氣味源有趨向性或正趨向性;進(jìn)入與對(duì)照瓶相連接的一臂記作該試蟲對(duì)該氣味源無趨向性或有負(fù)趨向性，未進(jìn)入兩臂的記作無反應(yīng)。每種化合物每次測(cè)試5頭，10次重復(fù)。更換不同氣味源時(shí)，用75%乙醇擦洗“Y”型管的內(nèi)、外壁，自然晾干，然后繼續(xù)進(jìn)行生測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

EAG反應(yīng)值由觸角電位儀讀出。

“Y”型嗅覺儀測(cè)試驅(qū)避率、引誘率及反應(yīng)率計(jì)算公式［9］:

驅(qū)避率=(對(duì)照臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測(cè)試的總蟲數(shù))×100%;

引誘率=(處理臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測(cè)試的總蟲數(shù))×100%;

反應(yīng)率=((對(duì)照臂內(nèi)的總蟲數(shù)+處理臂內(nèi)的總蟲數(shù))/測(cè)試的總蟲數(shù))×100%。

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Tukey多重比較。EAG反應(yīng)值用方差分析檢驗(yàn)其顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊扇舟蛾對(duì)不同植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

2.1.1 對(duì)14種揮發(fā)物最大濃度下的EAG反應(yīng)

楊扇舟蛾對(duì)10種揮發(fā)物(1 mol/L)與4種精油(原溶液稀釋100倍)的EAG反應(yīng)結(jié)果見表2。從EAG絕對(duì)值看:楊扇舟蛾對(duì)葉醇的EAG反應(yīng)最強(qiáng)，其次是對(duì)薄荷油的反應(yīng)。Tukey多重比較表明:楊扇舟蛾對(duì)丁香酚、異丁香酚、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯的EAG反應(yīng)值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，其中葉醇、薄荷油的EAG反應(yīng)值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)，對(duì)其他6種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)值與對(duì)照相比差異不顯著(P＞0.05)。

表2 楊扇舟蛾對(duì)14種揮發(fā)物最大濃度下的EAG反應(yīng)

2.1.2 對(duì)不同濃度的8種植物源揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

楊扇舟蛾成蟲對(duì)不同濃度的丁香酚、葉醇、異丁香酚、薄荷油、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯8種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)見表3。楊扇舟蛾成蟲對(duì)10－1mol/L的丁香酚的EAG反應(yīng)值最大，為0.056 mV。Tukey多重比較檢驗(yàn):成蟲在1 mol/L和10－1mol/L 2個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)。成蟲對(duì)1 mol/L葉醇的EAG反應(yīng)值最大，為0.080 mV，對(duì) 10－2mol/L 的 EAG 值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在 1 mol/L 和 10－1mol/L 2個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)10－1mol/L異丁香酚的EAG反應(yīng)值最大，為0.052 mV，在 1 mol/L 和 10－2mol/L 2 個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)稀釋103倍的薄荷精油的EAG反應(yīng)值最大，為0.072 mV，對(duì)稀釋104倍的精油的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在稀釋102與103倍2個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)1 mol/L紫羅蘭酮的EAG反應(yīng)值最大，為 0.048 mV，在 10－2mol/L濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在1 mol/L和10－1mol/L 2個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)濃度為10－1mol/L香葉醇的EAG反應(yīng)值最大，為0.052 mV，在1 mol/L和10－2mol/L 2個(gè)濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L 濃度下的EAG 值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)濃度為1 mol/L羅勒烯的 EAG反應(yīng)值最大，為0.055 mV，在10－2mol/L濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在1 mol/L 和 10－1mol/L 2 個(gè)濃度下的 EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對(duì)濃度為10－1mol/L α－蒎烯的 EAG 反應(yīng)值最大，為 0.069 mV，在1、10－2、10－3mol/L 3 個(gè)濃度下的 EAG 值與對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L 濃度下的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。

表3 楊扇舟蛾對(duì)不同濃度的8種植物源揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

2.2 楊扇舟蛾對(duì)不同揮發(fā)物的行為反應(yīng)

利用“Y”型嗅覺儀測(cè)定了楊扇舟蛾成蟲對(duì)丁香酚、葉醇、異丁香酚、薄荷油、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯8種揮發(fā)物不同濃度的行為反應(yīng)結(jié)果見表4。楊扇舟蛾成蟲對(duì)1 mol/L丁香酚的反應(yīng)率較大，同時(shí)引誘率較高，達(dá)到60%。對(duì)10－1mol/L葉醇的反應(yīng)率最大，為86%，引誘率也最大，達(dá)到64%。對(duì)10－1、10－2mol/L的異丁香酚的反應(yīng)率均比較大，其中10－1mol/L的引誘率，達(dá)56%。對(duì)薄荷油反應(yīng)呈引誘效果，但引誘率不高，3種稀釋倍數(shù)下均未達(dá)到50%。對(duì)10－1mol/L的紫羅蘭酮反應(yīng)率與驅(qū)避率較大，分別達(dá)到76%和56%。對(duì)10－1mol/L的香葉醇反應(yīng)率與引誘率都較大，分別達(dá)到76%和62%。對(duì)1、10－1mol/L羅勒烯的驅(qū)避率都比較大，分別達(dá)到62%和58%。對(duì)10－1mol/L的α－蒎烯的驅(qū)避率最大，達(dá)到64%。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用觸角電位(EAG)和“Y”型嗅覺儀測(cè)定14種植物源揮發(fā)物中對(duì)楊扇舟蛾成蟲的行為反應(yīng)起到強(qiáng)烈干擾作用的分別是葉醇、α－蒎烯。其中，濃度為10－1mol/L的葉醇對(duì)楊扇舟蛾成蟲引誘率達(dá)64%，10－1mol/L的α－蒎烯對(duì)楊扇舟蛾成蟲驅(qū)避率達(dá)64%。

表4 楊扇舟蛾成蟲對(duì)揮發(fā)物的行為反應(yīng)

植食性昆蟲在尋找寄主階段，主要通過嗅覺感受器對(duì)寄主植物特異性的化學(xué)指紋圖譜的識(shí)別而到達(dá)植物［10］。同一物質(zhì)的不同濃度對(duì)植食性昆蟲表現(xiàn)出不同的生理活性［11］，說明植物揮發(fā)物的特定濃度和不同揮發(fā)物的特定比例是影響昆蟲反應(yīng)的重要因子。楊扇舟蛾成蟲對(duì)各揮發(fā)物的EAG反應(yīng)并不是濃度越高反應(yīng)越強(qiáng)烈，可能是由于蟲體對(duì)能夠引起自身最大反應(yīng)的揮發(fā)物濃度有一定的極限。例如，楊扇舟蛾對(duì)10－1mol/L的異丁香酚、香葉醇和α－蒎烯要比低濃度或高濃度的同種化合物的EAG反應(yīng)更強(qiáng)烈。分析發(fā)現(xiàn)，EAG反應(yīng)值并沒有完全與“Y”型嗅覺儀生測(cè)結(jié)果相一致，如稀釋102倍的薄荷油對(duì)楊扇舟蛾的EAG值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)，但這個(gè)稀釋倍數(shù)并不能引起楊扇舟蛾成蟲明顯的定向作用，其中具體的原因還需進(jìn)一步的研究。在對(duì)楊扇舟蛾成蟲的生測(cè)試驗(yàn)中，遇到個(gè)別產(chǎn)卵后的試蟲表現(xiàn)出反應(yīng)較慢、不夠敏捷，這可能因?yàn)樵囅x在產(chǎn)卵前尋找寄主過程中揮發(fā)性化合物對(duì)其定向較強(qiáng)，而成蟲產(chǎn)卵后對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的敏感性降低，并且活動(dòng)能力下降造成的，因此，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)避免選用產(chǎn)卵后的楊扇舟蛾進(jìn)行生測(cè)試驗(yàn)。

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