張 敏 錢 猛 倪競德 黃利斌

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，南京，211153) (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) (江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院)

烏桕(Sapium sebiferum(L.)Roxb.)為大戟科(Euphorbiaceae)烏桕屬植物，是集能源、藥用、材用、觀賞為一體的多用途樹種。作為長江中下游地區(qū)重要的景觀樹種之一，烏桕季相變化豐富，秋葉由綠變黃、變紅或變紫，極具觀賞價值。目前，有關(guān)烏桕開發(fā)利用［1－3］、抗逆機理［4－5］以及繁育［6－8］的研究較多，而未見其葉片呈色機理的報道。深入了解烏桕葉色變化的生理生化基礎(chǔ)，尋求其葉色變化的原因及影響其呈色的相關(guān)因素，對提高烏桕的觀賞價值和進行新品種選育具有重要的理論意義和參考價值。

本研究以烏桕秋葉為試材，對比研究了黃、紅兩個單株的葉片在秋季變色前后色素、氮元素、淀粉、糖等生理指標(biāo)的差異及其相關(guān)性，還對葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化進行了分析，以探討烏桕秋葉的呈色規(guī)律，為選育秋季葉色純正的優(yōu)良觀賞株系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

在連續(xù)3 a葉色調(diào)查的基礎(chǔ)上，選取樹齡13 a、葉色性狀穩(wěn)定、生長健壯、長勢一致、秋季轉(zhuǎn)色后葉色分別為黃色和紅色的烏桕單株進行本次試驗。取樣地點位于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院大門口、寧丹路旁，取樣時間分別為2010年9月20日(變色前)和11月12日(變色后)10:00。黃色單株和紅色單株分別取樣，以變色前綠色葉片為對照，取樣部位及朝向基本相同。

生理生化指標(biāo)測定:葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用丙酮乙醇混合液法［9］，花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用鹽酸乙醇浸提法［10］，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用凱氏定氮法［11］，葡萄糖、果糖、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用Roche公司(Darmstadt，Germany)Sucrose/D－Glucose/D－Fructose試劑盒測定，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用Roche公司(Darmstadt，Germany)Starch試劑盒測定。各項檢測重復(fù)3次，結(jié)果用SPSS13.0系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察:取鮮葉洗凈、擦干，快速切取1 ～2 mm2，放入 2.5% 戊二醛溶液固定，0.1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸固定。再用0.1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗。30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮系列脫水，然后包埋劑逐級滲透，包埋，聚合后用瑞典LKB－V型超薄切片機進行超薄切片，鈾鉛染色，在日立H－600型透射電子顯微鏡下觀察并拍照［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏桕秋葉變色前后色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

黃、紅2種類型的烏桕秋葉中總?cè)~綠素、類胡蘿卜素、葉綠素a/b及花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。變色前后，2種類型秋葉中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及比值的差異較大。綠葉中總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.61、1.69 mg·g－1，均顯著高于其變色后黃葉(0.28 mg·g－1)和紅葉(0.33 mg·g－1)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.01);但變色后黃葉和紅葉中總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異(P＜0.05)。葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b兩種，前者呈藍綠色，后者呈黃綠色［13］。如表1所示，變色前葉綠素a和b之比略高于3;而變色后葉綠素a和b之比分別降低為1.95和1.38，說明葉綠素b的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所升高。

類胡蘿卜素是一類天然有色物質(zhì)，是葉綠素的伴生物，在秋葉顯色中具有重要作用［14］。從表1的結(jié)果可以看出，黃色秋葉類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，比變色前綠葉提高了17.50%;而紅葉單株變色前后，葉片中類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異。

秋季變色前后，黃葉單株葉片花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大;而紅葉中花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著升高，是綠葉的13.9倍，是黃葉的3.60倍。方差分析結(jié)果表明，紅葉中花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與綠葉和黃葉相比，均達到極顯著差異水平(P＜0.01)，說明花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低是決定烏桕紅色秋葉著色的主導(dǎo)因素之一。

表1 烏桕秋葉變色前后色素及氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.2 不同單株葉片氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

有研究表明，葉色差異與植物的氮素營養(yǎng)狀況密切相關(guān)［15］。從表1中可以看出，烏桕秋葉在變色后氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。黃葉和紅葉中氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比變色前綠葉降低27.92%和15.75%。其中，紅葉中的氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，方差分析結(jié)果表明，不同顏色葉片中氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 烏桕秋葉變色前后糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

糖是植物體內(nèi)碳水化合物運輸?shù)闹饕问?，作為花色素苷的前體物質(zhì)，在其合成過程中起重要作用［10］。從表2可以看出，烏桕葉片在秋季轉(zhuǎn)色后，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著降低(P＜0.01)。黃色秋葉中果糖和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比變色前綠葉降低了51.49%和 76.01%，差異極顯著(P＜0.01)。紅色單株的葉片在秋季轉(zhuǎn)色后，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，是變色前綠葉的1.25倍(P＜0.05);蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有所提高，但方差分析結(jié)果表明差異不顯著。

淀粉是碳的主要儲存物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在很大程度上影響著樹木的生長及對環(huán)境的響應(yīng)［16］。本研究中，黃色秋葉和紅色秋葉中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比變色前顯著降低(P＜0.01)(表2)，說明在葉片衰老過程中，光合產(chǎn)物儲備減少。

表2 烏桕秋葉變色前后非結(jié)構(gòu)性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 mg·g－1

植物葉片中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(TNC)是碳吸收(光合同化)與碳消耗(生長與呼吸消耗)關(guān)系的一種量度，反映了可供植物生長利用的物質(zhì)水平［17］。本研究結(jié)果表明，烏桕秋葉變色后非結(jié)構(gòu)性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，不同顏色由高到低排序為:綠葉、紅葉、黃葉，方差分析結(jié)果表明，差異達顯著水平(P＜0.05)。

2.4 色素與相關(guān)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表3)，總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與氮、葡萄糖、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān);類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān);花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與氮元素、葡萄糖、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，與果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，但均未達到顯著水平;花色素苷和葉綠素的比值與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表3 色素與全氮及非結(jié)構(gòu)性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)

2.5 烏桕秋葉變色前后葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析

利用透射電鏡分別對變色前綠葉、變色后黃葉和紅葉的葉肉細(xì)胞進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃葉單株的秋葉變色前，單位細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)較多，葉綠體沿細(xì)胞壁邊緣分布，形狀呈紡錘形或橢圓形，葉綠體膜完整，界限清晰。葉綠體中基質(zhì)物質(zhì)濃厚，淀粉粒豐富，有少量嗜鋨顆粒(圖1－A)。黃色秋葉葉綠體數(shù)目變少，形狀不規(guī)則，體積增大，被膜邊緣模糊，有的破裂;基質(zhì)片層疏松、不清晰，葉綠體中未見淀粉粒，嗜鋨顆粒增多(圖1－B)。

紅葉單株變色前葉肉細(xì)胞的葉綠體呈橢圓形，數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)片層及基粒片層清晰可見。類囊體系統(tǒng)發(fā)育完善，類囊體中不僅有大量的基質(zhì)片層，而且基粒較多，基粒垛疊較厚，基粒片層與基質(zhì)片層界限明顯，可以觀察到淀粉粒，但數(shù)量較少(圖1－C)。變?yōu)榧t色后，大部分細(xì)胞器已經(jīng)解體，基質(zhì)中出現(xiàn)囊泡，個別細(xì)胞中能夠觀察到正在解體退化的基粒片層殘片。嗜鋨顆粒大量增加，聚集在一起，基質(zhì)中無淀粉粒存在(圖1－D)。

圖1 烏桕秋葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、內(nèi)含物種類以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)等因素均能影響植物葉片的呈色［18］。色素是彩葉植物葉片呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中葉綠素、類胡蘿卜素和花色素苷是存在于葉片中的主要色素，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與比例是決定葉片呈色的主要因素［19］。烏桕秋葉在轉(zhuǎn)色過程中，不同種類的色素處于動態(tài)變化中，變色前葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，類胡蘿卜素和花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，葉片呈綠色;隨著秋季氣溫降低，葉綠體開始解體，總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。黃葉類型烏桕秋葉中類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅升高，葉片呈黃色;紅葉類型烏桕秋葉在葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的同時，花色素苷合成加快，質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇升高，葉片呈紅色。不同顏色烏桕秋葉中的色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異，紅色單株葉片中花色素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于黃色單株，成為烏桕秋葉呈現(xiàn)紅色的主要原因。

已有研究表明，葉色與全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化是同步的，葉色實際上是葉片氮化合物狀況的外在表現(xiàn)［20］。在本試驗中，氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，與花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈不顯著負(fù)相關(guān)。此結(jié)果與 Schaberg et al.［21］對糖槭(Acer saccharumMarsh.)秋葉的研究相一致。

對紅色起主導(dǎo)作用的花色素苷是由花青素和糖組成的糖苷，花青素又是在糖代謝的基礎(chǔ)上形成的［22］。還有報道指出，糖可作為信號物質(zhì)誘導(dǎo)花色素苷合成基因的表達和調(diào)節(jié)酶的活性［23］，因此，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)同烏桕秋葉顯色密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅色秋葉中果糖和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于變色前綠葉和黃色秋葉，表明果糖和蔗糖對烏桕葉片中花色素苷的累積有明顯的促進作用。葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，而與花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，分析原因可能是黃色和紅色秋葉在衰老過程中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，光合作用減弱，導(dǎo)致光合產(chǎn)物葡萄糖的積累受到影響。

碳水化合物是光合作用的主要產(chǎn)物，是樹木生長代謝過程中重要的能量來源。葉片同化的光合產(chǎn)物一部分用于構(gòu)建各種組織和器官，稱為結(jié)構(gòu)性碳水化合物，如木質(zhì)素、纖維素等;另一部分用于生理代謝活動，稱為非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(TNC)，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等［24］。已有研究表明非結(jié)構(gòu)性碳水化合物不僅在植株生命代謝中發(fā)揮重要作用，還是植物適應(yīng)環(huán)境的信號物質(zhì)［25－26］。烏桕秋季變色后，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，相關(guān)性分析表明，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)?？赡苁怯捎邳S色和紅色秋葉中光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，光合產(chǎn)物生成較少;同時類胡蘿卜素和花色素苷合成的基礎(chǔ)物質(zhì)是糖類物質(zhì)，其生成過程中也消耗了大量的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物。花色素苷的累積受激素、酶、光、pH值、溫度等多種因素的影響［27］，可能是本試驗中其與可溶性碳水化合物的相關(guān)性不明顯的原因之一。糖代謝與葉片呈色密切相關(guān)［28－29］，但其作用機制還有待于更深入細(xì)致的研究。

葉綠體是葉片進行光合作用的細(xì)胞器，也是植物葉片衰退進程中變化最靈敏的器官［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，烏桕秋季葉色改變前后，葉綠體數(shù)量、形狀以及基粒片層的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯變化，紅色秋葉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)比黃色秋葉更趨于簡單。葉綠體中的淀粉粒是細(xì)胞碳水化合物存在的主要形式之一。從觀察結(jié)果來看，綠葉中淀粉粒數(shù)量較多，體積較大，說明其葉綠體保持著活躍的光合作用功能。而葉色變黃或變紅后，淀粉粒數(shù)量減少、體積減小，甚至消失，其原因可能是當(dāng)葉綠體解體退化時，由于類囊體片層的減少，光合效率大大降低，淀粉的合成變慢，但水解速度加快，于是淀粉粒越來越小，直至最終消失［31］。烏桕秋葉變色后，嗜鋨顆粒大量增加，并聚集，這種變化與衰老葉片中退化葉綠體的結(jié)構(gòu)特點相似［32］。

總之，烏桕秋季葉色的變化是在多種因素的綜合作用下完成的，最直接的原因是色素的成分和比例發(fā)生改變，而相關(guān)生理指標(biāo)和葉綠體結(jié)構(gòu)的變化都是秋葉呈色的重要影響因素。

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