于永娟 牟芳芳 張澤安△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室，上海201203）

腦缺血缺氧性疾病是老年人多發(fā)和常見的一種疾病，由于腦缺血缺氧引起的細(xì)胞損傷涉及了多種信號(hào)通路異常，目前尚無特效藥物用于臨床。本文旨在通過觀察EGb761對(duì)腦缺血大鼠腦細(xì)胞中P38/MAPK和MEK/ERK的影響，從形態(tài)學(xué)和分子水平闡述EGb761的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠（300±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)2007000511866。

1.2 試劑 銀杏葉提取物（金納多片，20 mg/片，德國(guó)威瑪舒培博士藥廠）。10%水合氯醛溶液：上海國(guó)藥集團(tuán)。TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）：上海國(guó)藥集團(tuán)。Western blot相關(guān)試劑盒：購(gòu)自碧云天，β-Actin： signaling technology company， Cat： #4967。P38：購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司，BA1325。P-P38：Cell signaling technology company，Cat：#4631。 MEK： Cell signaling technology company，Cat：#9122。 P-MEK： Cell signaling technology company，Cat：#2338。 ERK： Cell signaling technology company，Cat：#4695。 P-ERK： Cell signaling technology company，Cat：#9106。 生物素化二抗：Vector，Cat：BA-1000。ABC： Vector，Cat： PK-6100。 DAB： Vector， Cat： SK-4100。

1.3 分組與給藥 大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組9只，假手術(shù)組10只，模型組15只，EGb761低劑量（50 mg/kg）組15只和EGb761高劑量（100 mg/kg）組15只。每日1次口服給藥，連續(xù)10 d。金納多片用0.5%CMC配成混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。假手術(shù)組給予0.5%CMC。

1.4 模型制備 給藥第11日，制備大腦中動(dòng)脈線栓（MCAO）腦缺血模型，使用內(nèi)徑約0.26 mm的尼龍線順著頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈，阻塞血流實(shí)現(xiàn)栓塞模型。栓塞60 min后，輕輕抽出線頭約2 cm，實(shí)現(xiàn)血流再灌注。造模前后腦血流減少＞75%認(rèn)為造模成功，腦血流減少＜75%的動(dòng)物剔除。再灌24 h后，處死動(dòng)物，取腦，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 TTC 染色［1］動(dòng)物麻醉后腹主動(dòng)脈放血，立刻取腦，切成厚約2～3 mm的薄片，浸入1%TTC中，37℃染色30 min，觀察腦組織梗死面積。

1.5.2 免疫組化檢測(cè) 腦組織固定于 10%甲醛中，24 h后脫水，常規(guī)方法制作切片。切片脫蠟，進(jìn)行熱抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液，pH=6.0，沸水中15 min），山羊正常血清封閉，一抗冰箱過夜，之后加入HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色。拍照，每張切片選取3個(gè)視野拍照，照片使用Nikon BR3.5圖像分析軟件分析定量。

1.5.3 Western blot檢測(cè) 動(dòng)物處死后立即取腦，加入蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和裂解液勻漿，冰上裂解30 min。Bradford法進(jìn)行蛋白定量，然后取70 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，PBS清洗后滴加羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗，加入ECL后使用TANON4500凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。蛋白條帶使用Quantityone軟件進(jìn)行定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SigmaSTAT4.0統(tǒng)計(jì)軟件。 數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析Dunnett法統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGb761對(duì)大鼠腦組織梗死體積的影響 見圖1。染成紅色部分為未缺血組織，白色部分為梗死組織。從結(jié)果可見，EGb761可劑量依賴性地減少大鼠腦組織梗死面積。

圖1 大鼠腦TTC染色

2.2 EGb761對(duì)大鼠腦缺血性組織Caspase-9和Caspase-3的影響 見圖2。與假手術(shù)組相比，不論皮質(zhì)部位，還是海馬部位，模型組動(dòng)物Caspase-9和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著性增多。EGb761各組Caspase-9/3陽(yáng)性細(xì)胞較模型組明顯減少（P＜0.05）。給予EGb761后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)劑量依賴性減少，但是Caspase-3表達(dá)僅有高劑量組教模型組具有顯著性減少（P＜0.05），而Caspase-9的表達(dá)在EGb761-50和EGb761-100組均顯著性減少（P＜0.05），這些結(jié)果表明，EGb761可劑量依賴性抑制凋亡信號(hào)傳遞，減少細(xì)胞凋亡。

圖2 大鼠腦Caspase-9和Caspase-3免疫組化結(jié)果

圖3 大鼠腦皮質(zhì)P38/P-P38蛋白表達(dá)變化

2.3 EGb761對(duì)缺血大鼠腦皮質(zhì)P-P38水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物皮質(zhì)，P-P38 的表達(dá)顯著上升（P＜0.05，圖3），表明缺血性損傷時(shí)P38被激活了。EGb761給藥后，P-P38的表達(dá)減少，與模型組相比，P-P38 的表達(dá)從模型組的（0.12±0.08）下降到給藥 EGb761-100 后的（0.07±0.03），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGb761-100 mg/kg 給藥顯著性抑制了P38/MAPK信號(hào)分子在腦缺血大鼠腦皮質(zhì)的激活。但是，EGb761組中P38蛋白與假手術(shù)組表達(dá)水平相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，缺血性損傷能夠直接引起P38/MAPK的磷酸化，從而引發(fā)下游信號(hào)的傳遞。由此，筆者推測(cè)EGb761的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制P38/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

2.4 EGb761給藥抑制了缺血大鼠腦組織中P-ERK，P-MEK的磷酸化水平 從圖4可見，與假手術(shù)組相比，ERK和MEK的總的蛋白水平在模型組和EGb761給藥組均未見明顯變化 （P＞0.05，圖4），而P-ERK的表達(dá)在模型組顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），分別為（0.05±0.04）和（0.16±0.05）。與模型組相比，P-MEK水平在EGb761各用藥組均有顯著下降（P＜0.05），但是P-ERK僅高劑量組相較模型組有顯著下降（P ＜0.05），從模型組（0.16±0.05）下降至（0.10±0.05）。 P-MEK 的表達(dá)相較模型組，各用藥組均顯著性下降（P＜0.05），分別從模型組（1.02±0.04）下降至低劑量組的（0.67±0.20）和高劑量組的（0.74±0.21）。 這些結(jié)果表明，腦缺血后，MEK和ERK均被激活，EGb761給藥后，一定程度上抑制了這兩個(gè)蛋白激酶的活化。

圖4 大鼠腦皮質(zhì)MEK/ERK蛋白表達(dá)變化

3 討 論

啟動(dòng)細(xì)胞凋亡一般通過兩條途徑，一條是內(nèi)源性凋亡信號(hào)系統(tǒng)，以Caspase-9的激活為標(biāo)志，另一條外源性凋亡信號(hào)通過激活Caspase-8，最終二者均可引起Caspase-3激活，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡［2］。已有實(shí)驗(yàn)證明P38/MAPK途徑的激活會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3-4］。P38MAPK被磷酸化激活后，可以進(jìn)一步激活其下游的激酶或多種轉(zhuǎn)錄因子，如蛋白激酶MAPKAPK2，轉(zhuǎn)錄因子ATF2，Elk-1等，產(chǎn)生一系列細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)，促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、選擇素、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β 等分子表達(dá)［5-6］。這些基因表達(dá)產(chǎn)物在腦缺血損傷時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用，。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明使用P38/MAPK的抑制劑可以減少缺血后細(xì)胞的凋亡［7］。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血60 min再灌24 h的大鼠腦缺血區(qū)，與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物P-P38和P-ERK均激活了，而EGb761給藥后，P-P38的表達(dá)減少（P＜0.05）。

Takagi等發(fā)現(xiàn)［8］，局灶性腦缺血再灌注后 5 min，皮質(zhì)及海馬的神經(jīng)元中P38MAPK，再灌注30 min達(dá)到高峰，而再灌注后72 h，上述激酶活性增強(qiáng)的區(qū)域中可發(fā)現(xiàn)凋亡的神經(jīng)元。表明P38激活促進(jìn)了凋亡途徑引起損傷。Ma XL等［7］研究發(fā)現(xiàn)SB 203580組與對(duì)照組相比，可減少缺血引起的心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)一步表明缺血性損傷引起的P38激活促進(jìn)了細(xì)胞損傷，而抑制P38活性具有細(xì)胞保護(hù)作用，但機(jī)制未明。Kevin等［9］在沙土鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)，p38/MAPK及其底物ATF2均有變化，MAPKAP2在腦缺血后持續(xù)數(shù)天活化，缺血后3～4 d酶活性最高，同時(shí)海馬區(qū)錐狀神經(jīng)元缺損最多，而JNK1和ERK的活化不明顯。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在缺血性疾病中，MEK激活的ERK促進(jìn)了細(xì)胞損傷，因?yàn)镸EK選擇性抑制劑SL327在缺血前15 min會(huì)減少64%梗死面積，同時(shí)，SL327減少了59%的IL-1β mRNA的表達(dá)，但是TNF-α不變。表明MEK抑制劑通過減少IL-1β而神經(jīng)保護(hù)作用［10］。另外，在MCAO造模前30 min和造模后30 min使用ERK的特異性阻斷劑UO126均可減少M(fèi)CAO后的損傷面積，認(rèn)為其保護(hù)作用是通過抑制了缺血引起的p－ERK1/2激活實(shí)現(xiàn)的［11］，MEK/ERK的激活可以促進(jìn)缺血后TNF-α的表達(dá)［12］，這些實(shí)驗(yàn)表明，MEK/ERK通路在腦缺血時(shí)的激活促進(jìn)了炎性因子釋放，從而加重了細(xì)胞損傷。通過抑制MEK/ERK的激活，會(huì)緩解炎性因子對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)直接或間接抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦缺血后P-ERK表達(dá)明顯增加，與QiaoH等［13-14］的結(jié)果相同，而EGB761用藥后，與大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌模型組相比，腦組織梗死面積減少，凋亡標(biāo)記TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞顯著性減少，Caspase-3表達(dá)減少。Caspase-3是啟動(dòng)凋亡程序的重要的蛋白分子，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的減少充分論證了EGb761可以抑制細(xì)胞的凋亡，同時(shí)在大鼠缺血后皮質(zhì)發(fā)現(xiàn)P-MEK和P-ERK在EGb761給藥組顯著下降（圖4）。由此，筆者認(rèn)為，EGb761通過抑制MEK/ERK的激活，阻斷了內(nèi)源性凋亡通路的激活，從而減少了細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)和蛋白表達(dá)水平研究了EGb761對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用及涉及的信號(hào)通路。從結(jié)果可知，EGb761可以通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮了缺血性損傷中的細(xì)胞保護(hù)作用，其作用機(jī)理涉及了凋亡通路，P38/MAPK和MEK/ERK信號(hào)通路。由于EGb761的多靶點(diǎn)藥理作用和對(duì)細(xì)胞無毒性的特點(diǎn)，本研究認(rèn)為其是一種可以有效預(yù)防和治療腦缺血的中藥，具有開發(fā)前景。

致謝：感謝上海中醫(yī)藥大學(xué)安評(píng)中心老師和同學(xué)們的無私幫助。

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