宋春滿，鄧建華

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南玉溪 653100)

煙蚜Myzus persicae是我國烤煙大田生產(chǎn)期的主要害蟲之一，不僅直接為害煙草葉片，降低煙葉品質(zhì)，而且傳播多種病毒病。目前煙蚜已對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，原有化學(xué)農(nóng)藥防治效果顯著降低。農(nóng)藥使用量的加大，不僅增加了防治成本，而且加劇了環(huán)境污染。進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)及抗性機(jī)理的研究，是科學(xué)制定抗性治理策略的前提。英國在上世紀(jì)70年代初就報(bào)道了桃蚜的抗藥性，其抗性機(jī)制也被相繼揭示 (Field et al.，1988，1996，1999，2002;Martinez－Torres et al.，1999;Guillemaud1 et al.，2003;Anstead et al.，2005;Srigiriraju et al.，2010)，并且發(fā)展了相應(yīng)的生物化學(xué)與分子生物學(xué)診斷技術(shù)，如利用RPLP－PCR診斷桃蚜的擊倒抗性和乙酰膽堿酯酶變構(gòu)，利用等位基因差異定量PCR技術(shù)進(jìn)行桃蚜擊倒抗性的高通量檢測(cè)等 (Field et al.，1997;Anstead et al.，2004;Cassanellietal.，2005;Crinitietal.，2008)。而國內(nèi)對(duì)煙蚜抗藥性的研究相對(duì)較少 (吳興富等，2004;宋春滿等，2006;顧春波等，2005，2007;劉筱兵等，2008)，至于寄生于煙草的煙蚜，其抗藥性機(jī)制國內(nèi)還少見報(bào)道。本文初步研究了云南煙蚜抗藥性的生化與分子機(jī)制，以期為抗性監(jiān)測(cè)與抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

毒扁豆堿、碘化硫代乙酰膽堿 (ATCh)、二硫雙硝基苯甲酸 (DTNB)為Fluka產(chǎn)品;固蘭B鹽、十二烷基硫酸鈉 (SDS)、α－乙酸萘酯 (α－NA)、β－乙酸萘酯 (β－NA)為上海生工產(chǎn)品。

酯酶擴(kuò)增檢測(cè)引物:E1 5'－GGGAATTTTGGATTCT－3'，E2 5'－GGCGGACCTGACGACTC －3'，E3 5'－ TGGTTGGGATCTAGGG －3'。

鈉離子通道突變檢測(cè)引物:CH1 5'－ATCTGGCATAAGTCTAAGAG －3'，CH2 5'－ GTCATGGGTATGCAG TTATTTG －3'，CH3 5'－ CTACTGTTGTCATTGGTAACC －3'，CH4 5'－ ATAGTACTTATACATACCACGAA－3'。引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.1.2 供試煙蚜

煙蚜相對(duì)敏感品系、煙蚜抗氧化樂果品系(抗性倍數(shù)112.9)、煙蚜抗滅多威品系 (抗性倍數(shù)44.7)、煙蚜抗高效氟氯氰菊酯品系 (抗性倍數(shù)26.3)，4個(gè)煙蚜品系均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自行篩選獲得，以K326煙葉隔離飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi)，溫度25℃，光照14L∶10D。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶液制備

挑選室內(nèi)飼養(yǎng)的個(gè)體大小一致的無翅成蚜，每 20頭加 1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液 (pH8.0，0.02 mol/L)，直接于1.5 mL離心管中低溫研磨，12000 r/m離心15 min，上清液即為酶液。

1.2.2 解毒酶與靶標(biāo)酶活力比較

分別以α－乙酸萘酯 (α－NA)、β－乙酸萘酯 (β－NA)為底物，比較抗性品系煙蚜和敏感品系煙蚜的羧酸酯酶 (CarE)活力。羧酸酯酶活力測(cè)定:2.5 mL磷酸緩沖液 (0.02 mol/L，pH8.0)，加1 mL α －NA 或 β －NA(3×10－4mol/L，含10－5mol/L毒扁豆堿)、50 μL酶液，于37℃保溫30 min后加0.5 mL顯色劑 (1%固藍(lán)B與5%SDS以 2∶5配制)，穩(wěn)定 10 min后測(cè)定 A600或A555。

比較抗性品系煙蚜和敏感品系煙蚜的乙酰膽堿酯酶 (AChE)活力。乙酰膽堿酯酶活力測(cè)定:2.6 mL磷酸緩沖液 (0.02 mol/L，pH8.0)，加200 μL 酶液、50 μL ATCh(75 mmol/L)，于 30℃保溫15 min后加入100 μL DTNB(10 mmol/L)，再加毒扁豆堿100 μL(1 mmol/L)終止反應(yīng)，測(cè)定A412。

1.2.3 抗性的分子檢測(cè)

(1)煙蚜DNA提取:按楊子祥 (2006)等方法進(jìn)行。

(2)煙蚜酯酶基因擴(kuò)增檢測(cè)

反應(yīng)體系:Taq酶 1U;10×Buffer 2 μL;MgCl22 μL;dNTP 2 μL;E1 1.5 μL;E2 1.5 μL;E3 1.5 μL;DNA 1.5 μL;ddH2O 9.3 μL。

反應(yīng)程序:94℃ 3 min;94℃ 1 min，52℃1 min，72℃ 2 min，35cycles;72℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

(3)煙蚜鈉離子通道突變檢測(cè)

反應(yīng)體系:Taq酶 1U;10×Buffer 2 μL;MgCl22 μL;dNTP 2 μL;CH1 1.5 μL;CH2 1.5 μL;CH3 1.5 μL;CH4 1.5 μL;DNA 1.5 μL;ddH2O 6.3 μL。

反應(yīng)程序:94℃ 2 min;94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 30 s，35 cycles;72℃ 8 min。

反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙蚜解毒酶與靶標(biāo)酶活力比較

分別以α－NA、β－NA為底物比較了煙蚜抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶活力，結(jié)果如表1，由表1可知，煙蚜敏感品系與抗性品系之間，α－NA羧酸酯酶活力差異顯著，其中以抗氧化樂果品系活力最高，抗滅多威品系次之，抗高效氟氯氰菊酯品系較低。β－NA羧酸酯酶活力在抗性品系與敏感品系之間差異不顯著。由此可見，α－NA羧酸酯酶活力增強(qiáng)是煙蚜對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑氧化樂果、氨基甲酸酯類殺蟲劑滅多威以及菊酯類殺蟲劑高效氟氯氰菊酯的抗性機(jī)制之一。

煙蚜敏感品系與抗性品系的乙酰膽堿酯酶(AChE)活力表明，煙蚜抗氧化樂果品系的AChE活力與敏感品系差異顯著，但增幅較小，抗滅多威品系的AChE活力與敏感品系差異不顯著。由此可知，AChE在煙蚜對(duì)氧化樂果的抗性中起著重要作用，但不排除還有AChE敏感性降低的因素。

表1 煙蚜抗性品系與敏感品系酶活力比較Table 1 Difference of enzyme activity among susceptible strain and resistant strain

2.2 酯酶擴(kuò)增檢測(cè)

酯酶基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1，根據(jù)報(bào)道 (Field1 et al.，1999，2002)，如果煙蚜酯酶基因發(fā)生了擴(kuò)增，即基因拷貝數(shù)增加，所設(shè)計(jì)的引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增的電泳條帶應(yīng)為572 bp或865 bp強(qiáng)帶，如果酯酶基因沒有發(fā)生擴(kuò)增，則PCR擴(kuò)增產(chǎn)生572 bp和865 bp兩條弱帶，據(jù)此可以判斷，3個(gè)抗性品系煙蚜均沒有發(fā)生酯酶基因擴(kuò)增。一般認(rèn)為煙蚜酯酶基因拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致了酯酶的過量表達(dá)，從而產(chǎn)生對(duì)殺蟲劑的抗性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，云南煙蚜3個(gè)抗性品系均未發(fā)生酯酶結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增，說明云南煙蚜的抗性仍處于較低的水平。

2.3 鈉離子通道突變檢測(cè)

圖1 酯酶基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Map of PCR product of esterase genes on agarose gel electrophoresis

鈉離子通道基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖2，根據(jù)報(bào)道 (Guillemaud et al.，2003)，如果煙蚜鈉離子通道為抗性純合型 (kdr/kdr)，則PCR擴(kuò)增產(chǎn)生300 bp條帶，如果煙蚜鈉離子通道為敏感純合型 (kds/kds)，則PCR擴(kuò)增產(chǎn)生600 bp條帶，如果煙蚜鈉離子通道為抗性雜合型 (kdr/kds)，則PCR擴(kuò)增產(chǎn)生300、600 bp條帶。據(jù)此可以判斷，抗高效氟氯氰菊酯品系煙蚜為抗性雜合型，即抗高效氟氯氰菊酯煙蚜品系發(fā)生了鈉離子通道突變。一般認(rèn)為煙蚜對(duì)擬除蟲菊酯的擊倒抗性與鈉離子通道發(fā)生改變有關(guān) (Martinez－Torres et al.，1999)，本文結(jié)果與此相符。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)敏感品系煙蚜也為抗性雜合型，這說明將有機(jī)磷相對(duì)敏感品系作為擬除蟲菊酯相對(duì)敏感品系不合適。

圖2 鈉離子通道PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Map of PCR product of sodium channel on agarose gel electrophoresis

3 結(jié)論與討論

有關(guān)桃蚜的抗性機(jī)制，在遺傳學(xué)主要有3種。第一種機(jī)制:認(rèn)為兩種相似的羧酸酯酶 (E4或FE4)的過量產(chǎn)生導(dǎo)致了抗性，它們隔離和降解某些農(nóng)藥以阻止其到達(dá)靶標(biāo)部位，產(chǎn)生了對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑高水平抗性和氨基甲酸酯類殺蟲劑的低水平抗性，以及對(duì)菊酯類殺蟲劑的一定抗性。Field等 (1999，2002)對(duì)桃蚜與殺蟲劑抗性有關(guān)的酯酶基因進(jìn)行了克隆和分析，發(fā)現(xiàn)酯酶過量產(chǎn)生是其結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增的結(jié)果。第二種機(jī)制:認(rèn)為乙酰膽堿酯酶敏感性降低導(dǎo)致桃蚜對(duì)氨基甲酸酯的極強(qiáng)抗性 (Guillemaud1 et al.，2003)。第三種機(jī)制:對(duì)擬除蟲菊酯的擊倒抗性與鈉離子通道發(fā)生改變有關(guān)。對(duì)于擬除蟲菊酯抗性，鈉離子通道突變起主要作用，酯酶機(jī)制只起增強(qiáng)的次要作用(Martinez－Torres et al.，1999)。本文研究表明，云南煙蚜α－NA羧酸酯酶活力的增強(qiáng)是云南煙蚜對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑氧化樂果、氨基甲酸酯類殺蟲劑滅多威以及菊酯類殺蟲劑高效氟氯氰菊酯的抗性機(jī)制之一，但未發(fā)現(xiàn)酯酶基因擴(kuò)增，僅僅是酶活力的增強(qiáng)，這與Field等 (1999)的結(jié)果有所不同，這可能是因?yàn)檫x擇壓力不高，尚未導(dǎo)致酯酶基因拷貝數(shù)的增加，這也表明云南煙蚜對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的抗性水平仍然不高，這有利于抗性的治理。AChE活力的增強(qiáng)對(duì)有機(jī)磷抗性有一定貢獻(xiàn)，至于AChE是否發(fā)生變構(gòu)，尚需進(jìn)一步研究。本文研究發(fā)現(xiàn)，抗擬除蟲菊酯煙蚜品系發(fā)生了鈉離子通道突變，這與前人研究結(jié)果相符，敏感品系檢測(cè)結(jié)果也為抗性雜合型，說明擬除蟲菊酯相對(duì)敏感品系選擇不夠合適，這也是抗性品系雖然檢出鈉離子通道發(fā)生突變，然而生物測(cè)定仍顯示抗性水平不高 (26.3倍)的原因。

References)

Anstead JA，Williamson MS，Eleftherianos I，Denholm I，2004.High －throughput detection of knockdown resistance in Myzus persicae using allelic discriminating quantitative PCR.Insect Biochemistry and Molecular Biology，34:871－877.

Anstead JA，Williamson MS，Denholm I，2005.Evidence for multiple origins of identical insecticide resistance mutations in the aphid Myzus persicae.Insect Biochemistry and Molecular Biology，35:249－256.

Cassanelli S，Cerchiari B，Giannini S，Bizzaro D，Mazzoni E，Manicardi GC，2005.Use of the RFLP－PCR diagnostic test for characterizing MACE and kdr insecticide resistance in the peach potato aphid Myzus persicae.Pest Management Science，61:91－96.

Criniti A，Mazzoni E，Cassanelli S，Cravedi P，Tondelli A，Bizzaro D，Manicardi GC，2008.Biochemical and molecular diagnosis of insecticide resistance conferred by esterase，MACE，kdr and superkdr based mechanisms in Italian strains of the peach potato aphid，Myzus persicae(Sulzer)．Pesticide Biochemistry and Physiology，90:168－174.

Field LM，Devonshie AL，F(xiàn)orde BG，1988.Molecular evidence that insecticide resistance in peach－potato aphid(Myzus persicae Sulz.)results from amplification of an esterase gene.Biochemical Journal，251:309－312.

Field LM，Crick SE，Devonshie AL，1996.Polymerase chain reactionbase identification of insecticide resistance genes and DNA methylation in the aphid Myzus persicae(Sulzer)．Insect Molecular Biology，5(3):197－202.

Field LM，Anderson AP，Denholm I，F(xiàn)oster SP，Harling ZK，Javed N，Martinez－Torres D，Moores GD，Williamson MS，Devonshire LA，1997.Use of biochemical and DNA diagnostics for characterising multiple mechanisms of insecticide resistance in the peach－potato aphid，Myzus persicae(Sulzer)．Journal of Pesticide Science，51:283－289.

Field LM，Blackman RL，Tyler－Smith C，Devonshie AL，1999.Relationship between amount of esterase and gene copy number in insecticide － resistant Myzus persicae(Sulzer)．Biochemical Journal，339:737－742.

Field LM，F(xiàn)oster SP，2002.Amplified esterase genes and their relationship with other insecticide resistance mechanisms in English field populations of the aphid，Myzus persicae(Sulzer)．Pest Management Science，58(9):889－894.

Guillemaud1 T，Brun1 A，Anthony N，Sauge MH，Boll R，Delorme R，F(xiàn)ournier D，Lapchin P，Vanlerberghe－Masutti F，2003.Incidence of insecticide resistance alleles in sexually－reproducing populations of the peach－potato aphid Myzus persicae(Hemiptera:Aphididae)from southern France.Bulletin of Entomological Research，93:289－297.

Gu CB，Wang KY，Xin HJ，Guo QL，Wang G，2005.Study on the resistance of Myzus Persicae(Sulzer)in major tobacco planting areas in Shandong Province.Acta Tabacaria Sinica，11(4):21－23.［顧春波，王開運(yùn)，辛海軍，郭慶龍，王剛，2005．山東省主要煙區(qū)煙 (桃)蚜抗藥性研究．中國煙草學(xué)報(bào)，11(4):21－23］

Gu CB，Wang KY，Xin HJ，Guo QL，Wang G，2005.Study on the resistance of Myzus persicae(Sulzer)in major tobacco planting areas in Shandong Province.Acta Tabacaria Sinica，11(4):21－23.［顧春波，王開運(yùn)，辛海軍，郭慶龍，王剛，2005．山東省主要煙區(qū)煙 (桃)蚜抗藥性研究．中國煙草學(xué)報(bào)，11(4):21－23］

Liu XB，Liu CM，2008.Resistance of Myzus persicae(Sulzer)to insecticides in the major tobacco－planting areas of Fujian Province.Entomological Journal of East China，17(4):253－258.［劉筱兵，劉長(zhǎng)明，2008．福建主要煙區(qū)煙蚜抗藥性．華東昆蟲學(xué)報(bào)，17(4):253－258］

Martinez－Torres D，F(xiàn)oster SP，F(xiàn)ield LM，Devonshire AL，Willliamson MS，1999.A sodium channel point mutation is associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides in the peach－potato aphid，Myzus persicae(Sulzer)(Hemiptera:Aphididae)．Insect Molecular Biology，8(3):339－346.

Song CM，Wu XF，Deng JH，Lei CL，2006.Monitoring insecticide resistance of Myzus persicae in tobacco fields in Yunnan.Chinese Bulletin of Entomology，43(4):500－503.［宋春滿，吳興富，鄧建華，雷朝亮，2006．云南主要煙區(qū)煙蚜抗藥性的監(jiān)測(cè)．昆蟲知識(shí)，43(4):500－503］

Song CM，Wu XF，Deng JH，Lei CL，2006.Activity of detoxicating enzyme of Myzus persicae in different tobacco areas of Yunnan.Journal of Environmental Entomology，28(2):55－60.［宋春滿，鄧建華，吳興富，雷朝亮，2006．云南主要煙區(qū)煙蚜種群解毒酶活力比較．環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，28(2):55－60］

Srigiriraju L，Semtner PJ，Anderson TD，Bloomquist JR，2010.Monitoring for MACE resistance in the tobacco－adapted form of the green peach aphid，Myzus persicae(Sulzer)(Hemiptera:Aphididae)in the eastern United States.Crop Protection，29:197－202.

Wu XF，Liu GH，Deng JH，Ye JW，Song CM，Song K，2004.Primary studies on the difference of insecticides resistance of myzus nicotiance(Blackman)in Yunnan.Journal of Yunnan Agricultural U-niversity，19(1):73－77.［吳興富，劉光輝，鄧建華，葉佳偉，宋春滿，宋昆，2004．云南煙蚜的抗藥性差異研究初報(bào)．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，19(1):73－77］

Yang ZX，Chen XM，F(xiàn)eng Y，Miao YC，2006.Method improvement for extraction genomic DNA from aphids.Chinese Bulletin of Entomology，43(6):880－884.［楊子祥，陳曉鳴，馮穎，繆迎春，2006．蚜蟲基因組 DNA提取方法的改進(jìn)．昆蟲知識(shí)，43(6):880 －884］