趙利華,韋良玉,陳煌,王進聲,楊柯,黃燕

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艾灸對D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶、大腦組織NOS/NO-cGMP信號系統(tǒng)及c-fosmRNA的影響

趙利華1,韋良玉1,陳煌1,王進聲2,楊柯3,黃燕4

(1.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院針灸科,南寧 530023;2.廣西中醫(yī)學(xué)院病理教研室,南寧 530001;3.廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,南寧 530001;4.廣西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,南寧 530001)

探討艾灸療法改善學(xué)習(xí)記憶的作用機制。將72只雄性小鼠隨機分為生理組、模型組、艾灸1組、艾灸2組、電針組和尼莫地平組,每組12只。模型組及艾灸組連續(xù)42 d于小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖,生理組注射等量生理鹽水。造模第13天開始干預(yù)治療,艾灸1組灸足三里、懸鐘穴,艾灸2組灸關(guān)元、百會穴,隔天治療1次,共治療15次。采用水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶,檢測腦組織勻漿一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量,原位雜交檢測各組小鼠大腦皮層、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA的表達。模型組“潛伏期”較生理組、艾灸1組、艾灸2組、尼莫地平組延長(＜0.01,＜0.05),模型組“原象比”和“垮臺次數(shù)”較其他各組縮短、降低(＜0.01,＜0.05)。模型組腦組織NO含量、總一氧化氮合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力較其他5組均顯著升高(均＜0.01),模型組腦組織cGMP含量較其他5組均顯著降低(均＜0.01)。模型組小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA表達的神經(jīng)元密度較其他5組均降低(＜0.01,＜0.05)。艾灸療法可能通過提高cNOS的活力,生成生理活性的NO,增加第二信使cGMP的含量,即通過NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),促進大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞c-fosmRNA表達,維持長時程增強(LTP),改善學(xué)習(xí)記憶能力。

針灸療法;灸法;學(xué)習(xí)記憶;D-半乳糖;一氧化氮合酶;環(huán)磷酸鳥苷;c-fosmRNA

NOS/NO-cGMP信號系統(tǒng)廣泛存在于體內(nèi),NO做為鳥苷酸環(huán)化酶內(nèi)源性活化因子,促進cGMP的合成[1];海馬區(qū)的NO-cGMP可誘導(dǎo)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的長時程增強效應(yīng)(Long-term potetiation;LTP)[2];LTP的誘導(dǎo)也伴有c-fos基因表達增強,因此,人們認(rèn)為c-fos基因的表達和蛋白質(zhì)合成是LTP能夠維持?jǐn)?shù)星期乃至數(shù)月的物質(zhì)基礎(chǔ),并將c-fos基因作為學(xué)習(xí)記憶功能的客觀指標(biāo)之一[3]。隨著增齡腦內(nèi)不同類型的NOS的改變,從而改變了體內(nèi)NO的水平,進而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP水平下降[4]。學(xué)習(xí)記憶減退是腦衰老的重要表現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦為髓海,增齡等引起的腦衰老則為髓海失養(yǎng)?！鹅`樞·海論》:“髓海不足,則腦轉(zhuǎn)耳鳴,脛酸眩冒,目無所見,懈怠安臥?！薄夺t(yī)林改錯》:“高年無記性者,腦髓漸空也?！卑陌贂兔T兩穴,能起到補髓作用,促進老年學(xué)習(xí)記憶減退大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生[5]。歷代醫(yī)家都重視艾灸的養(yǎng)生保健作用,本研究通過觀察艾灸療法對D-半乳糖衰老小鼠腦組織NOS/NO-cGMP信號系統(tǒng)及c-fosmRNA的影響,了解艾灸療法改善學(xué)習(xí)記憶的作用機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康3月齡昆明雄性小鼠72只,體重為(30±2)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心SPF實驗室提供(SCXK桂2003-0003)。實驗前,動物置于廣西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF級實驗室(桂E動字第11004號)飼養(yǎng)5 d,適應(yīng)環(huán)境,自由攝食和飲用純凈水,室溫保持在(24±2)℃,相對濕度65%,12 h晝夜交替。用Morris水迷宮(Morris Water Maze Test,MWM)篩選游泳距離不低于2600 cm/2 min、體重不低于28 g的72只健康雄性小鼠。按隨機區(qū)組設(shè)計分為生理組、造模組、艾灸1組、艾灸2組、電針組、尼莫地平組6組,每組12只。

1.2 試劑與儀器

D-半乳糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供);NO硝酸還原酶法試劑盒(20081129,南京建成生物工程研究所提供);NOS化學(xué)比色法試劑盒(20081127,南京建成生物工程研究所提供)測TNOS、iNOS;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒(20081129,南京建成生物工程研究所提供)采用抽提法測分型SOD(Cu-Zn、總SOD);總蛋白定量測試盒(20081129,南京建成生物工程研究所提供)采用考馬斯亮蘭法;cGMP用放射免疫法檢測,125I-cGMP試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實驗室提供);c-fosmRNA試劑盒(武漢博士德公司提供)。HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(中國國華儀器廠提供);JY92-IID超聲波細(xì)胞破碎機(中國寧波儀器廠提供);TGL-16M臺式高速冷凍離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司提供);LD4-1.8臺式低速離心機離心機(北京京立離心機有限公司提供);721分光光度計(上海光學(xué)儀器廠提供);FJ-2008P型g放射免疫計數(shù)器(國營二六二廠提供)。

1.3 1 MWM行為測試實驗

MWM實驗的第2天至第6天,進行定位航行試驗。平臺位于第三象限,沒于水下1 cm,小鼠入水點為各象限(分為1、2、3、4象限)池壁中點,每天分上、下午兩個時間段,每時間段每鼠訓(xùn)練4次,且每鼠每次訓(xùn)練間隔時間不能低于1 min。訓(xùn)練期間迷宮外參照物(包括實驗者)及環(huán)境保持不變,訓(xùn)練每天在上午9點至下午6點進行,訓(xùn)練時將小鼠面向池壁(背向平臺)由4個入水點放入水池中,測其60 s內(nèi)成功進駐平臺(小鼠找到平臺并滯留其上5 s為成功進駐)所需時間(即逃避潛伏期)。如在60 s內(nèi)小鼠不能成功進駐平臺,則實驗者將其引上平臺并令其停留10 s,記錄逃避潛伏期為60 s。潛伏期能綜合反映出小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及運動行為能力,其值越小,說明小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力越強。

實驗第7天,進行空間探索實驗。撤除平臺,從1象限(原平臺象限對側(cè))池壁中點將小鼠放入水中,電腦記錄2 min內(nèi)小鼠在原平臺象限的游泳時間和游泳軌跡。原平臺象比(簡稱“原象比”)越大,跨越平臺次數(shù)(簡稱“跨臺次數(shù)”)越多,說明小鼠學(xué)習(xí)、記憶及行為能力越強。

定位航行試驗指標(biāo)和空間探索實驗指標(biāo)可綜合反映出小鼠在平臺撤除后所發(fā)生的探索反應(yīng),從而綜合評判小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及行為能力。

1.4 造模方法

參照文獻[6]用D-半乳糖頸背部皮下注射。將D-半乳糖試劑與生理鹽水按1.2(g):100(mL)混勻為(12 mg/mL),造模組及各干預(yù)治療組以D-半乳糖120 mg/kg/d頸背部皮下注射,連續(xù)42 d,同時對生理組頸背部皮下注射等量的生理鹽水42 d。

1.5 治療方法

造模第13天開始治療,艾灸1組和艾灸2組進行艾炷灸,時間選擇上午9:00-11:30,艾灸1組灸足三里、懸鐘穴,艾灸2組灸關(guān)元、百會穴,灸后用棉簽輕輕按壓穴位,每次每穴3壯。定位取穴按照《實驗動物針灸手冊》[7],穴位選定后剪毛,施灸時涂凡士林以保護小鼠皮膚且便于固定艾炷,艾炷做得緊而結(jié)實(底座直徑2 mm,高度5 mm,重量13～15 mg),用線香點燃,每壯時間為18～20 s,當(dāng)小鼠掙扎時更換艾炷。電針組將輸出電流正極接足三里穴,負(fù)極接懸鐘穴,用20 Hz連續(xù)波,電流0.24～0.30 mA,以小鼠肢體輕微抖動、不嘶叫為度,每次3 min。尼莫地平組采用尼莫地平(山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司)灌胃,劑量按體表面積等效折算計算法,予以每天每公斤12 mg灌胃。治療方法均為隔天治療1次,共治療15次。生理組和造模組不做任何治療性干預(yù),但給予與治療組同樣時間、同等程度的捉抓。

1.6 樣本采集和制備、檢測

1.6.1 腦組織NO、NOS、cGMP檢測

治療結(jié)束,MWM再測試后,將各組小鼠斷頭處死,迅速取右側(cè)大腦組織(在冰面上操作)稱重,按g/v=1:9比例加入冰生理鹽水進行勻漿,低溫離心機2000轉(zhuǎn)離心10 min。提取上清液,樣本置－20℃保存,待測。另取左側(cè)大腦組織50 mg,放入盛有2 mL冷的50 mMpH4.75醋酸緩沖液的試管內(nèi)(冰浴),勻漿,加入2 mL無水乙醇,混勻,靜止5 min,3500轉(zhuǎn)離心15 min,將上清液收集在青霉素小瓶內(nèi),再用75%乙醇2 mL沖洗沉淀,勻漿分散,混勻,3500轉(zhuǎn)離心15 min,合并上清,60℃烘箱烘干,殘渣放置于4℃保存,測量時用1 mL醋酸緩沖溶解,然后取0.1 mL測量大腦組織cGMP含量。按試劑盒說明書要求測各項指標(biāo)。

1.6.2 c-fosmRNA原位雜交檢測

原位雜交試劑盒采用特異性針對c-fos的寡核苷酸探針,經(jīng)地高辛標(biāo)記。針對小鼠c-fos靶基因的mRNA序列為,(1)5’-TCCTT CTCCA GCATC GGCTC GCCTG TCAAC-3’(2)5’—CTTCT ATGCA GCAGA CTGGG AGCCT CTGCA-3’(3)5’—CTTAC ACGTC TTCCT TCGTC TTCAC CTACC-3’。原位雜交實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進行。陰性對照,除不加探針雜交液外,其余步驟相同。原位雜交陽性信號以細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性的神經(jīng)元,采用Matic Images Advanced 3.2病理圖文分析系統(tǒng),在高倍(10×40)顯微鏡視野下于每張病理切片皮層部位、海馬CA3區(qū),分別選取不相重疊連續(xù)的10、6個視野,計數(shù)完整陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù),其與視域參考面積(3292.76、1975.66mm2)的比值(單位面積神經(jīng)元數(shù))即是陽性神經(jīng)元表達密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

各組定位航行實驗指標(biāo)用SPSS13.0進行重復(fù)測量的數(shù)據(jù)分析,各組空間探索試驗,腦組織NO、NOS、cGMP檢測,c-fosmRNA的表達指標(biāo)進行多個樣本均數(shù)的方差分析以及均數(shù)間兩兩比較(SNK-q檢驗和LSD 法),以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

生理組和艾灸2組治療后各死亡2只,艾灸1組和尼莫地平組各死亡1只。

2.1 各組治療前后水迷宮各項指標(biāo)比較

由表1可見,各組造模前定位航行、空間探索指標(biāo)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。治療后,模型組潛伏期較其他5組延長(均＜0.01),模型組原象比及垮臺次數(shù)較其他5組縮短、降低(＜0.01,＜0.05)。生理組治療后潛伏期與艾灸2組、電針組、尼莫地平組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。

表1 各組治療前后水迷宮各項指標(biāo)比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與生理組比較3)＜0.01,4)＜0.05

2.2 各組治療后大腦組織NO含量及NOS分型活力比較

由表2可見,模型組治療后腦組織NO含量、TNOS及iNOS活力較其他5組顯著升高(均＜0.01)。其他5組腦組織NO含量、TNOS、iNOS活力比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。

表2 各組治療后大腦組織NO含量及NOS分型活力比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01

2.3 各組治療后cGMP含量及大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA表達比較

由表3可見,模型組腦組織cGMP含量較其他5組顯著降低(均＜0.01),其他5組腦組織cGMP比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。模型組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA陽性表達神經(jīng)元密度較其他5組降低(＜0.01,＜0.05)。尼莫地平組海馬CA3區(qū)c-fosmRNA陽性表達神經(jīng)元密度與艾灸1組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

表3 各組治療后cGMP含量及大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA表達比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與艾灸1組比較3)＜0.05

3 討論

NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中一種重要的生物信使分子,在CNS中具有雙重作用,過量的NO則會作為強氧化劑與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng),對細(xì)胞產(chǎn)生毒性從而導(dǎo)致衰老的發(fā)生[4]。隨著增齡各型NOS的表達會發(fā)生相應(yīng)的變化,老年大鼠和認(rèn)知損傷大鼠均表現(xiàn)為其海馬和皮質(zhì)nNOS活性降低而iNOS活性升高[8]。cNOS的生物效應(yīng)以細(xì)胞間信息傳遞為主,NO-cGMP是重要的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而iNOS其生物效應(yīng)以細(xì)胞毒為主,其合成的NO不依賴cGMP直接發(fā)揮作用[1]。

學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)長時程增強(Long-term potetiation,LTP),是突觸可塑性的一種形式,被認(rèn)為與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān),是神經(jīng)元學(xué)習(xí)和記憶機制的模式之一。人們對LTP的機制及其影響因素進行了大量研究,發(fā)現(xiàn)NO作為逆行信使參與了LTP[9],突觸后NOS合成的NO,作為逆行信使,增加突觸前膜生成第二信使cGMP含量,通過促進突觸前谷氨酸(Glu)激活突觸后的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體,Ca2＋進入突觸后膜與鈣調(diào)素(CaM)一起激活NOS,又產(chǎn)生NO,從而形成NO-cGMP信號系統(tǒng),誘導(dǎo)和維持LTP[10];cGMP作為新的信使分子,又可誘導(dǎo)c-fos、c-jun等即早基因的表達[11];國外學(xué)者Dragunow率先發(fā)現(xiàn)在清醒大鼠海馬齒狀回誘導(dǎo)LTP可導(dǎo)致即刻早期基因(Immediate early genes,IEGS)表達增高,IEGS再激活靶基因進而合成各種相應(yīng)的蛋白質(zhì),對各種刺激起反應(yīng),這是突觸重塑即學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ),即海馬-LTP-IEGs通路[12]。國內(nèi)學(xué)者[13]認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶在細(xì)胞水平上的機制為長時程增強,它取決于神經(jīng)細(xì)胞永久性功能改變,要求基因表達上的重新編程,c-fos基因正是作為這一過程中的第三信使來調(diào)節(jié)核內(nèi)其他靶基因,從而影響學(xué)習(xí)記憶。

在我們以往的研究中已經(jīng)證實,D-半乳糖衰老小鼠大腦組織中NO的含量與NOS的活力都有增高,與18月齡衰老小鼠相似[14],究竟是何種類型的NOS活力增加,生成NO,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,或是否參與NO-cGMP信號系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑呢?又如何進一步維持LPT?本研究觀察發(fā)現(xiàn),D-半乳糖致衰老小鼠大腦組織NO、總一氧化氮合酶(TNOS)的活力升高,主要與iNOS的升高有關(guān)。TNOS的活力是cNOS和iNOS活力的總和,實驗結(jié)果分析可以得出模型組cNOS活力較其他5組降低。而生理組、艾灸1組、艾灸2組、電針組、尼莫地平組的大腦組織cGMP含量、大腦皮質(zhì)和海馬回的CA3的c-fosmRNA的表達神經(jīng)元密度較模型組明顯升高,學(xué)習(xí)記憶改善。提示艾灸、電針、尼莫地平可以減低D-半乳糖致衰老小鼠iNOS的活力,提高cNOS的活力,產(chǎn)生具有信使作用的NO,增加cGMP含量,形成逆行釋放機制促進LTP,同時cGMP又作為第二信使增加了大腦皮質(zhì)和海馬回CA3的c-fosmRNA基因表達的神經(jīng)元密度,c-fos基因作為第三信使構(gòu)成了LTP能夠維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的物質(zhì)基礎(chǔ),提高了D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。因此,艾灸療法可能通過提高cNOS的活力,依賴Ca2＋/CaM途徑產(chǎn)生生理濃度NO,增加第二信使cGMP的含量,即通過NO-cGMP信號系統(tǒng),誘導(dǎo)與維持LPT,又通過cGMP促進c-fosmRNA的表達,再進一步從神經(jīng)元的基因和蛋白功能結(jié)構(gòu)上維持LPT,改善學(xué)習(xí)記憶能力。

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Effect of Moxibustion on Learning and Memory, and Cerebral NOS/NO-cGMP Signal Transduction System and Expression of C-fos mRNA in D-galactose-Induced Senile Mice

-1,-1,1,-2,3,4.

1.,,530023,; 2.,,530001,; 3.,530001,; 4.,,530001,

To explore the mechanism of improving action of moxibustion on learning and memory.Seventy-two male mice were randomly allocated to normal, model, moxibustion 1, moxibustion 2, electroacupunctue and Nimodipine groups, 12 mice each. The model and moxibustion groups of mice received nuchal subcutaneous injections of D-galactose for 42 consecutive days. The normal group was injected with an equal volume of normal saline. Treatment was given at 13 days after model making. In moxibustion 1 group, moxibustion was performed on points Zusanli and Xuanzhong and in moxibustion 2 group, on points Guangyuan and Baihui. Treatment was provided once every other day, for a total of 15 times. Learning and memory were assessed using a water maze. The nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS ) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) contents of brain homogenates were measured. The expression of c-fos mRNA in the cerebral cortex and hippocampal CA3 region was examined by in situ hybridization in each group of mice.The “l(fā)atency” lengthened significantly in the model group compared with the normal, moxibustion 1, moxibustion 2 and Nimodipine groups (＜0.01,＜0.05). The targeted quadrant time and the spanning (original) platform frequency decreased in the model group compared with the other groups (＜0.01,＜0.05). Cerebral NO content, total nitric oxide synthase (TNOS) and induced nitric oxide synthase (iNOS) activities increased significantly in the model group compared with the other five groups (＜0.01). Cerebral cGMP content decreased significantly in the model group compared with the other five groups (＜0.01). The density of c-fos mRNA-expressing neurons in the cerebral cortex and hippocampal CA3 region decreased significantly in the model group of mice compared with the other five groups (＜0.01,＜0.05).Moxibustion can maintain long-term potentiation (LTP) and improve learning ability and memory through increasing cNOS activity to produce bioactive NO and raising second messenger cGMP content, that is, promoting the expression of neuronal c-fos mRNA in the cerebral cortex and hippocampal CA3 region by means of a NO-cGMP signal transduction system.

Acupuncture-moxibustion therapy; Moxibustion method; Learning and memory; D-galactose; Nitric oxide synthase; Cyclic guanosine monophosphate; C-fos mRNA

1005-0957(2012)03-0194-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.03.194

2011-08-01

廣西自然科學(xué)基金(桂科自0832170)

趙利華(1967 - ),女,教授,博士,E-mail:zhaolh67@163.com