楊文靜 鄧婧 曲紅梅

隨著抗生素的大量應(yīng)用，口腔厭氧菌的耐藥性呈增加趨勢［1］。因此天然物質(zhì)將作為治療口腔疾病的新方法，目前有超過25%的處方及非處方藥來源于植物［2］。中草藥也將為抗厭氧菌藥物的研制提供廣闊的前景。丹參作為祖國傳統(tǒng)藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。丹參的有效成分為水溶性(如:丹參素)及脂溶性(丹參酮ⅡA等［3］)兩大部分。不同的提取方法獲得的丹參主要成分不同［4］。丹參對金黃色葡萄球菌和其他耐藥菌株有較強(qiáng)的抑菌作用［5，6］，但對厭氧菌的抑菌性研究較少。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用丹參不同的提取液對口腔厭氧菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，研究其抑菌性，為其在口腔領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 (1)藥物:丹參生藥，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥廠提供;(2)菌株:牙齦卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)ATCC 33277，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S)，伴放線放線桿菌 (A.actinomycetemcomitans，A.a)ATCC 24523，乳酸桿菌(Lactobacillus，LB)均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所提供;(3)培養(yǎng)基MSA平板培養(yǎng)基，CDC平板培養(yǎng)基，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所自配。

1.2 方法

1.2.1 丹參液的制備

1.2.1.1 丹參水煎液:200 g丹參生藥經(jīng)水煎兩次，合并濾液。留出一半液體(70 ml)，蒸發(fā)至25 ml(4000 mg生藥/ml)。按倍比稀釋原則，用蒸餾水將丹參水煎液制成8個(gè)濃度的制劑(最大濃度為4000 mg/ml)，高壓消毒，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 50%醇沉丹參液:剩余70 ml，進(jìn)行50%的乙醇醇沉，(即加入70 ml 100%乙醇靜置12 h后，取上清液80 ml，再加入80 ml 50%乙醇靜置2 h，取上清液，并在真空負(fù)壓下，溫度50℃，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流乙醇，)得到25 ml丹參液(4000 mg生藥/ml)。稀釋及消毒同上。

1.2.1.3 95%醇取丹參的提取:500 g丹參用95%乙醇3 L浸泡12 h后過濾，再加入95%乙醇3 L浸泡1.5 h過濾，并在真空負(fù)壓下，溫度50℃，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流乙醇，得到250 ml丹參液(2000 mg生藥/ml)。使其自然蒸發(fā)至膏狀。用95%乙醇將95%醇取丹參浸膏溶解，配成4000 mg生藥/ml的液體;按倍比稀釋原則，用95%乙醇稀釋成8個(gè)濃度的制劑;用過濾器(0.22 μm)過濾消毒，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn):變形鏈球菌采用MSA平板培養(yǎng)基，置于厭氧罐中，微需氧環(huán)境(N290%，CO25%)，37℃溫箱孵育48 h;牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌采用CDC平板培養(yǎng)基，置于厭氧罐中，厭氧環(huán)境(N280%，H210%，CO210%)，37℃ 溫箱孵育120 h;乳酸桿菌采用CDC平板培養(yǎng)基:置于厭氧罐中，微需氧環(huán)境，37℃溫箱孵育120 h。

用取菌環(huán)取菌種均勻密布于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、增菌;從各平板培養(yǎng)基上取新鮮的細(xì)菌，用取菌環(huán)將其溶于一定量生理鹽水中，使成細(xì)菌懸液，細(xì)菌達(dá)到108～109 cfu/ml;在每個(gè)新配好的各平板培養(yǎng)基中滴入0.1 ml菌懸液，用三角棒均勻涂布;每一平板培養(yǎng)基內(nèi)放入3～4個(gè)鋼管(鋼管內(nèi)徑6mm，外徑8mm，高10mm)，每個(gè)鋼管之間留有一定的距離，在鋼管內(nèi)加入不同濃度的測試溶液。按上述孵育條件孵育。設(shè)95%酒精作為對照組。以上每次實(shí)驗(yàn)的每一藥物濃度重復(fù)2次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.3 丹參液成分的測定:用HPLC法測定丹參提取液中丹參素、丹參酮的含量。

2 結(jié)果

2.1 三種丹參液對牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌均有抑菌性，95%乙醇對照組無抑菌性。

2.2 水煎丹參液對牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌的最低抑菌濃度分別為 31.25、125.00、125.00、125.00 mg/ml。其中 4000 、2000 、1000 mg/ml的水煎丹參液對牙齦卟啉菌的抑菌性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他濃度之間抑菌性隨濃度的增加而增加(P＜0.05)。對變形鏈球菌、伴放線放線桿菌的抑菌性隨濃度的增加而增加(P＜0.05)。對乳酸桿菌的抑菌性，4000 mg/ml與1000 mg/ml差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2000 mg/ml的抑菌性略低，但與500、250 mg/ml之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);其他濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。

50%醇沉丹參液對牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌的最低抑菌濃度分別為 62.50、62.50、500.00、15.62 mg/ml。對牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌的抑菌性隨濃度的增加而增加(P＜0.05)。

95%醇取丹參液對牙齦卟啉菌、伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌的最低抑菌濃度分別為 15.62、15.62、62.50、15.62 mg/ml。對變形鏈球菌隨濃度的增加而增加(P＜0.05)。對牙齦卟啉菌的抑菌性4000 mg/ml與500 mg/ml無差別(P ＞0.05);余濃度之間有差別(P ＜0.05)。對伴放線放線桿菌的抑菌性4000 mg/ml與250、125 mg/ml無差別(P＞0.05);而500 mg/ml的抑菌環(huán)最大與其他濃度有差別(P＜0.05)。對乳酸桿菌的抑菌性各濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 通過對三種丹參液的抑菌性進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)95%醇取丹參對伴放線放線桿菌的抑菌性在各濃度下均優(yōu)于水煎丹參和50%醇沉丹參(P＜0.05)，而水煎丹參和50%醇沉丹參的抑菌性無差別(P＞0.05);對乳酸桿菌的抑菌性有顯著差別(P＜0.05)，水煎丹參低于另兩種丹參液;對變形鏈球菌的抑菌性:濃度為 4000 、2000 、1000 、500、250 mg/ml時(shí)，95% 醇取丹參液的抑菌性優(yōu)于水煎丹參液及50%醇沉丹參液(P＜0.05)，在 2000 、1000 、500 mg/ml時(shí) 50%醇沉丹參液的抑菌性優(yōu)于水煎丹參液(P＜0.05);對牙齦卟啉菌的抑菌性:高濃度(2000、1000 mg/ml)時(shí)水煎丹參的抑菌性優(yōu)于另兩種丹參液(P ＜ 0.05)，而在低濃度(500、250 mg/ml、125 mg/ml、62.5 mg/ml、31.25 mg/ml)時(shí)95%醇取丹參的抑菌性優(yōu)于另兩種丹參液(P ＜0.05)。見表1～4。

表1 不同方法提取的丹參液對伴放線放線桿菌的抑菌性 n=6，mm，

表1 不同方法提取的丹參液對伴放線放線桿菌的抑菌性 n=6，mm，

藥物濃度(mg/ml) 水煎丹參 50%醇沉丹參 95%醇取丹參4000 .00 14.33 ±0.61 14.17 ±0.26 14.95 ±0.232 000.00 12.97 ±0.38 12.93 ±0.10 14.03 ±0.331 000.00 11.83 ±0.26 12.12 ±0.18 12.50 ±0.45500 .00 10.92 ±0.20 11.23 ±0.26 16.50 ±0.55250 .00 10.67 ±0.52 10.57 ±0.64 15.00 ±0.32125 .00 9.50 ±0.55 10.17 ±0.26 14.33 ±0.4162 .50 8.00 ±0.00 8.25 ±0.27 13.17 ±0.4131 .25 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 12.28 ±0.2315 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 11.50 ±0.55

表2 不同方法提取的丹參液對乳酸桿菌的抑菌性 n=6，mm，

表2 不同方法提取的丹參液對乳酸桿菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 13.53 ±0.49 14.13 ±0.22 15.23 ±0.52 8.藥物濃度(mg/ml) 水煎丹參 50%醇沉丹參 95%醇取丹參 95%00 ±0.002 000.00 10.33 ±0.52 13.50 ±0.45 11.15 ±0.23 8.00 ±0.001 000.00 11.83 ±0.98 13.42 ±0.49 13.32 ±0.40 8.00 ±0.00500 .00 11.50 ±0.55 12.17 ±0.26 12.83 ±0.26 8.00 ±0.00250 .00 10.50 ±0.55 12.67 ±0.75 12.08 ±0.20 8.00 ±0.00125 .00 9.67 ±0.61 12.17 ±0.25 12.58 ±0.49 8.00 ±0.0062 .50 8.90 ±0.35 10.83 ±0.41 13.92 ±0.20 8.00 ±0.0031 .25 8.00 ±0.00 10.58 ±0.49 11.10 ±0.47 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 9.10 ±0.24 9.33 ±0.52 8.00 ±0.00

表3 不同方法提取的丹參液對變形鏈球菌的抑菌性 n=6，mm，

表3 不同方法提取的丹參液對變形鏈球菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 17.00 ±0.63 16.83 ±0.25 18.58 ±0.80 8.藥物濃度(mg/ml) 水煎丹參 50%醇沉丹參 95%醇取丹參 95%00 ±0.002 000.00 14.67 ±0.61 15.50 ±0.55 16.33 ±0.52 8.00 ±0.001 000.00 10.67 ±0.61 13.33 ±0.52 14.67 ±0.52 8.00 ±0.00500 .00 10.42 ±0.49 11.33 ±0.52 12.00 ±0.32 8.00 ±0.00250 .00 9.83 ±0.26 8.58 ±0.38 10.42 ±0.49 8.00 ±0.00125 .00 9.48 ±0.41 8.00 ±0.00 9.17 ±0.26 8.00 ±0.0062 .50 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.42 ±0.38 8.00 ±0.0031 .25 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00

表4 不同方法提取的丹參液對牙齦卟啉菌的抑菌性 n=6，mm，

表4 不同方法提取的丹參液對牙齦卟啉菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 24.50 ±0.54 25.13 ±0.21 22.00 ±0.89 8.藥物濃度(mg/ml) 水煎丹參 50%醇沉丹參 95%醇取丹參 95%0000 ±0.002 000.00 25.83 ±0.52 20.30 ±0.24 14.67 ±0.82 8.00 ±0.001 000.00 24.41 ±0.66 17.00 ±0.89 13.75 ±0.76 8.00 ±0.00500 .00 14.92 ±0.66 14.43 ±0.38 21.83 ±0.75 8.00 ±0.00250 .00 13.50 ±0.45 12.58 ±0.38 18.22 ±0.45 8.00 ±0.00125 .00 11.08 ±0.66 10.10 ±0.72 13.50 ±0.45 8.00 ±0.0062 .50 9.58 ±0.66 9.43 ±0.50 13.67 ±0.61 8.00 ±0.0031 .25 8.50 ±0.55 8.00 ±0.00 11.37 ±0.53 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.31 ±0.40 8.00 ±0.

2.4 不同方法提取的丹參液成分。丹參素:水提取液1.38 mg/g，50%乙醇提取液0.48 mg/g，95% 乙醇提取液0.28 mg/g。丹參酮:水提取液 0.040 mg/g，50% 乙醇提取液0.637 mg/g，95%乙醇提取液 7.574 mg/g。

3 討論

丹參具有免疫調(diào)節(jié)、改善微循環(huán)作用，對革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌作用，目前已在許多臨床科室用于感染性疾病的治療，且長期應(yīng)用無毒副作用出現(xiàn)［7，8］。不同方法提取的丹參液成分不同，實(shí)驗(yàn)表明，95%醇取丹參液的主要成分為丹參的脂溶性部分:丹參酮;水煎丹參液主要為水溶性成分:丹參素;50%醇沉丹參液包含兩種成分，但丹參素的含量低于水煎丹參，丹參酮的含量低于95%醇取丹參液。這與以往的報(bào)道［3］相似。

實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)菌中，牙齦卟啉菌，是牙周病病變區(qū)或活動(dòng)部位最主要的優(yōu)勢菌，與牙周炎在治療后復(fù)發(fā)或病情繼續(xù)加重有關(guān)，是目前公認(rèn)的牙周致病菌;伴放線放線桿菌對牙周炎特別是青少年牙周炎的發(fā)病具有重要意義，變形鏈球菌及乳酸桿菌與齲齒的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參對這四種菌有一定的抑菌效果。其中95%醇取丹參的對伴放線放線桿菌、變形鏈球菌、乳酸桿菌的抑菌性優(yōu)于另兩種丹參液(P＜0.05)，說明丹參酮對該三種細(xì)菌的抑菌性強(qiáng)于丹參素，50%醇沉丹參對乳酸桿菌及變形鏈球菌的抑菌性優(yōu)于水煎丹參液(P＜0.05)，也說明了這一點(diǎn)。而對于牙齦卟啉菌的抑菌性，在高濃度時(shí)水煎丹參也優(yōu)于另兩種(P＜0.05)，可能是一定濃度的丹參素對牙齦卟啉菌的抑菌性較好，這一點(diǎn)需要以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。通過統(tǒng)計(jì)分析，探尋到丹參液對4種細(xì)菌的最低抑菌濃度，為以后丹參組方應(yīng)用于臨床提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

口腔的感染性疾病多為以厭氧菌為主的混合感染，由于合成抗生素耐藥問題的增加，從植物中尋找天然的抗菌藥物已引起人們的關(guān)注。該實(shí)驗(yàn)表明，丹參的水溶性及脂溶性成分對口腔的常見厭氧菌均有一定的抑菌性，可考慮將其制備成漱口液、牙周緩釋膜等不同的劑型應(yīng)用于牙周病、齲病等口腔疾病的預(yù)防和治療等。

1 王淑敏.牙周厭氧菌耐藥性及其控制途徑.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，37:310-313.

2 Allaker RP，Douglas CW.Novel anti-microbial therapies for dental plaque-related diseases.Int J Antimicrob Agenta，2009，33:8-13.

3 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》委員會.中華本草.第1版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998.1653.

4 劉重芳，張鈺泉，戴居云，等.丹參不同提取工藝比較.中成藥，1999，21:385-388.

5 孫吉蘭，常云亭，宋海英，等.丹參的體外抑菌作用研究.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14:725.

6 朱嘉蓉，羅厚蔚.丹參酮ⅡA的抑菌活性研究.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35:368-370.

7 石乃玉，董華民，黃海金.丹參酮藥理及臨床應(yīng)用.中國醫(yī)師雜志，2001，3:150-151.

8 王定邦，劉愛生，丹參酮治療痤瘡的初步報(bào)告.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1980，2:187-188.