蔣春琴 冷向軍李小勤 季曉琳 施登科

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實驗室，上海 201306)

棉酚又稱棉毒素或棉籽醇，是棉籽色素腺體中的黃色多酚型色素，按存在形式可分為結(jié)合棉酚和游離棉酚。結(jié)合棉酚無毒性，在動物消化道內(nèi)大部分不被吸收而排出，小部分則會在體內(nèi)分解成游離棉酚。游離棉酚有毒性，主要由其所含的活性醛基和活性羥基產(chǎn)生毒性，不僅對心臟、肝臟、腎臟等實質(zhì)性器官及神經(jīng)、血管有毒害作用，而且能與棉籽蛋白中賴氨酸的ε－氨基(ε-NH2)發(fā)生美拉德反應(yīng)，降低其營養(yǎng)價值。由于棉籽粕在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用較廣，因此研究游離棉酚對水產(chǎn)動物的影響具有重要的意義。目前，有關(guān)游離棉酚對水產(chǎn)動物毒害作用方面的研究較少。富惠光等［1］研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚和金魚幼魚攝食含0.1%醋酸棉酚(游離棉酚的一種存在形式)的飼料，生長未見異常;Lee等［2］報道，用棉籽粕完全替代魚粉飼養(yǎng)虹鱒3年，未對其生長產(chǎn)生不利影響;Robinson［3］研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加 25% ～30%低棉酚棉籽粕(游離棉酚含量為0.022%)，對斑點(diǎn)叉尾的生長無不良影響;姜光明等［4］研究得出，異育銀鯽攝食含720 mg/kg醋酸棉酚的飼料，生長未受到抑制;Herman［5］認(rèn)為，游離棉酚對虹鱒有很強(qiáng)的毒害作用，當(dāng)攝食飼料游離棉酚含量達(dá)0.03%時，魚體表現(xiàn)為食欲下降和生長不良;Barros等［6］研究發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)叉尾攝食含55.0%棉籽粕(游離棉酚含量為671 mg/kg)的飼料后，其增重率顯著下降。由此可知，水產(chǎn)動物因品種不同而對游離棉酚的敏感程度存在著較大差異。

本試驗以異育銀鯽為研究對象，在基礎(chǔ)飼料中以醋酸棉酚的形式添加游離棉酚，旨在考察游離棉酚對異育銀鯽生長性能、形體指標(biāo)、肌肉成分、血清生化指標(biāo)及棉酚殘留的影響，為棉籽粕在水產(chǎn)飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照組)、300和900 mg/kg醋酸棉酚(均指純醋酸棉酚含量，所用醋酸棉酚購于北京中棉紫光科技有限公司，純度為98%)，配制成3種試驗飼料。原料棉籽粕中游離棉酚含量為 674.15 mg/kg，小于 GB 13078—2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［7］規(guī)定的游離棉酚允許量(≤1 200 mg/kg)，基礎(chǔ)飼料中棉籽粕含量為15.60%，實測游離棉酚含量為137.37 mg/kg。飼料原料均粉碎過40目篩，逐級混勻后再經(jīng)制粒機(jī)加工成直徑為1 mm的顆粒料，晾干備用?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗用異育銀鯽購于上海市孫橋養(yǎng)殖場。選取平均體重為(31.68±0.01)g、體質(zhì)健壯的試驗魚270尾，隨機(jī)分為3組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。

飼養(yǎng)試驗在上海海洋大學(xué)南匯特種養(yǎng)殖場進(jìn)行，試驗魚以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于水泥池(3.0 m×2.5 m ×1.2 m，水深 0.6 m)中，試驗前馴化 1 周，待魚攝食正常后開始試驗。每日分別于08:30、12:30和16:30各投喂1次，投飼量為體重的3%～4%，并根據(jù)水溫﹑天氣﹑攝食情況進(jìn)行調(diào)整。各組保持一致的投飼量，晝夜充氣，定期換水。飼養(yǎng)試驗期間，水溫22～32℃，溶氧6.5～8.3 mg/L，pH 6.9 ～7.8，飼養(yǎng)時間為 8 周。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長性能指標(biāo)

試驗結(jié)束后饑餓24 h，對魚體進(jìn)行稱重，計算增重率、飼料系數(shù)、特定生長率和成活率。

1.3.2 形體指標(biāo)

試驗結(jié)束后饑餓24 h，每重復(fù)選取5尾魚，用于測定體長體高比、肥滿度、內(nèi)臟指數(shù)和肝胰指數(shù)。

1.3.3 肌肉成分

試驗結(jié)束后饑餓24 h，每重復(fù)選取3尾魚，測定其肌肉中水分、灰分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量。其中，水分含量采用105℃恒重法測定;灰分含量采用550℃灰化法測定;粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定;粗脂肪含量采用索氏抽提法測定。

1.3.4 血清生化指標(biāo)

試驗結(jié)束后饑餓24 h，每重復(fù)選取6尾魚，尾靜脈取血1 mL，6 000 r/min離心5 min得血清，于－20℃冰箱保存待測。其中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOP)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性均采用比色法測定;堿性磷酸酶(AKP)活性采用一磷酸腺苷(AMP)緩沖液法測定;總蛋白(TP)含量采用雙縮脲法測定;肌酐(CREA)含量采用改良JAFF法測定;尿素(UREA)含量采用紫外－谷氨酸脫氫酶法測定;總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量均采用氧化酶法測定;總膽紅素(T-Bil)含量采用釩酸鹽氧化法測定;葡萄糖(Glu)含量采用葡萄糖氧化酶法測定;鈣(Ca)含量采用偶氮胂－Ⅲ法測定。上述指標(biāo)均采用邁瑞B(yǎng)S－200全自動生化分析儀測定。

1.3.5 肌肉和肝臟游離棉酚含量

試驗結(jié)束后饑餓24 h，每重復(fù)選取10尾魚，對魚體進(jìn)行解剖，取肝臟及側(cè)線以上2側(cè)背肌，冷凍干燥處理后－20℃冰箱保存待測。游離棉酚含量采用GB 13086—1991《飼料中游離棉酚的測定方法》［8］中的苯胺比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

除成活率外，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 醋酸棉酚對異育銀鯽生長性能的影響

由表2可知，隨著醋酸棉酚添加量的增加，異育銀鯽的增重率和特定生長率逐漸降低，而飼料系數(shù)則逐漸升高。與對照組相比，添加300 mg/kg醋酸棉酚組增重率降低了8.43%(P＜0.05)，特定生長率降低了5.82%(P＜0.05)，飼料系數(shù)升高了7.69%(P ＞0.05);添加 900 mg/kg醋酸棉酚組增重率降低了12.22%(P＜0.05)，特定生長率降低了 7.94%(P＜0.05)，飼料系數(shù)升高了14.69%(P＜0.05)。8周的飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，各組的成活率均為100%。

表2 醋酸棉酚對異育銀鯽生長性能的影響Table 2 Effects of gossypol-acetic acid on growth performance of Carassius auratus gibelio

2.2 醋酸棉酚對異育銀鯽形體指標(biāo)的影響

由表3可知，隨著醋酸棉酚添加量的增加，異育銀鯽的肥滿度逐漸降低，其中添加900 mg/kg醋酸棉酚組顯著低于對照組(P＜0.05);而肝胰指數(shù)則逐漸升高，其中添加900 mg/kg醋酸棉酚組顯著高于對照組和添加300 mg/kg醋酸棉酚組(P＜0.05)。異育銀鯽的內(nèi)臟指數(shù)隨著醋酸棉酚添加量的增加呈降低趨勢，但組間差異不顯著(P＞0.05)。各組異育銀鯽的體長體高比無顯著差異(P ＞0.05)。

表3 醋酸棉酚對異育銀鯽形體指標(biāo)的影響Table 3 Effects of gossypol-acetic acid on physical indices of Carassius auratus gibelio

2.3 醋酸棉酚對異育銀鯽肌肉成分的影響

由表4可知，醋酸棉酚添加量對異育銀鯽肌肉水分、灰分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均未產(chǎn)生顯著影響(P ＞0.05)。

表4 醋酸棉酚對異育銀鯽肌肉成分的影響Table 4 Effects of gossypol-acetic acid on muscle composition of Carassius auratus gibelio %

2.4 醋酸棉酚對異育銀鯽血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，添加900 mg/kg醋酸棉酚組異育銀鯽的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和肌酐含量顯著高于對照組(P＜0.05)，而血清堿性磷酸酶活性和總蛋白含量則顯著低于對照組(P＜0.05);添加300 mg/kg醋酸棉酚組異育銀鯽上述指標(biāo)的值介于對照組與添加900 mg/kg醋酸棉酚組之間，與上述2組均無顯著差異(P＞0.05)。各組異育銀鯽的血清尿素、總膽固醇、甘油三酯、總膽紅素、葡萄糖和鈣含量無顯著差異(P＞0.05)。

2.5 醋酸棉酚對異育銀鯽肌肉和肝臟游離棉酚含量的影響

由表6可知，隨著醋酸棉酚添加量的增加，異育銀鯽的肌肉和肝臟游離棉酚含量逐漸增加。其中，添加300 mg/kg醋酸棉酚組肌肉和肝臟游離棉酚含量較對照組分別增加了14.87%(P＜0.05)和 26.23%(P ＜0.05);添加 900 mg/kg 醋酸棉酚組肌肉和肝臟游離棉酚含量較對照組分別增加了 30.57%(P ＜0.05)和 57.84%(P ＜0.05)。

3 討論

3.1 醋酸棉酚對異育銀鯽生長性能的影響

不同魚類對于游離棉酚的敏感程度不同。Robinson 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(初重 1.0 g)攝食含0.1% ～0.2%醋酸棉酚的半純合飼料后，其生長速度、飼料系數(shù)與對照組無顯著差異;姜光明等［4］報道，異育銀鯽攝食含醋酸棉酚720 mg/kg的飼料180 d后，其生長未受到抑制;Dorsa等［10］在斑點(diǎn)叉尾的試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中游離棉酚含量小于0.09%時魚體生長不受影響，當(dāng)游離棉酚含量增加到0.12%時生長顯著下降;曾虹等［11］以醋酸棉酚形式添加游離棉酚，當(dāng)飼料中游離棉酚含量在400 mg/kg以上時，鯉魚生長受到抑制，肝臟中棉酚蓄積量與飼料中游離棉酚含量呈正相關(guān);Mediha等［12］研究發(fā)現(xiàn)，以含1 500 mg/kg 醋酸棉酚的飼料喂養(yǎng)斑點(diǎn)叉尾12周，魚體增重率顯著降低，部分個體出現(xiàn)停食現(xiàn)象。

表5 醋酸棉酚對異育銀鯽血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of gossypol-acetic acid on serum biochemical indices of Carassius auratus gibelio

表6 醋酸棉酚對異育銀鯽肌肉和肝臟游離棉酚含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 6 Effects of gossypol-acetic acid on free gossypol content in muscle and liver of Carassius auratus gibelio(DM basis) mg/kg

本試驗中，異育銀鯽攝食添加300 mg/kg醋酸棉酚的飼料后，其增重率較對照組顯著降低，當(dāng)飼料中醋酸棉酚添加量增加到900 mg/kg時，魚體增重率進(jìn)一步降低，飼料系數(shù)進(jìn)一步升高，肝胰指數(shù)則顯著升高，說明游離棉酚對異育銀鯽的危害表現(xiàn)明顯，魚體肝臟出現(xiàn)腫大現(xiàn)象。但在姜光明等［4］的試驗中，異育銀鯽攝食添加720 mg/kg醋酸棉酚飼料后，生長并未受到抑制。導(dǎo)致上述2個試驗的結(jié)果不一致的原因可能在于:姜光明等［4］試驗中魚體生長較慢，養(yǎng)殖60 d時對照組增重率為53.01%，飼料系數(shù)為1.50;而本試驗中養(yǎng)殖56 d時對照組增重率為187.4%，飼料系數(shù)為1.43。在飼料系數(shù)基本一致的情況下，低增重率意味著低采食量，低采食量意味著對游離棉酚的低攝入量，而低攝入量的游離棉酚可能在機(jī)體的代謝能力和耐受范圍內(nèi)，因而姜光明等［4］試驗的飼料中添加720 mg/kg醋酸棉酚沒有表現(xiàn)出對魚體生長的抑制，而本試驗的飼料中添加300 mg/kg醋酸棉酚卻顯著降低了魚體增重率。此外，姜光明等［4］試驗的基礎(chǔ)飼料中沒有棉籽粕，而本試驗的基礎(chǔ)飼料中含15.6%棉籽粕(137.37 mg/kg游離棉酚)。棉籽粕中的游離棉酚與以醋酸棉酚形式添加的游離棉酚是否具有不同的作用效果，值得進(jìn)一步研究。

3.2 醋酸棉酚對異育銀鯽血清生化指標(biāo)的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶作為評價肝功能的重要指標(biāo)，可以反映肝臟的受損情況。蔣春琴等［13］研究發(fā)現(xiàn)，與游離棉酚含量為104.23 mg/kg的對照飼料相比，異育銀鯽攝食游離棉酚含量為260.57 mg/kg的飼料，其血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性分別增加了7.70%和16.78%。本試驗中，當(dāng)醋酸棉酚添加量為300 mg/kg時，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化不顯著;而當(dāng)醋酸棉酚添加量達(dá)到900 mg/kg時，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高，表明高劑量的醋酸棉酚可能使異育銀鯽的肝功能受到了一定程度的損傷。

血清總蛋白常作為魚體對環(huán)境應(yīng)激因子反應(yīng)的指示物［14］，血清堿性磷酸酶在生物體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過程，在魚體內(nèi)的物質(zhì)代謝和免疫防護(hù)中發(fā)揮重要作用［15］。本試驗中，醋酸棉酚添加量為900 mg/kg時，異育銀鯽的血清總蛋白含量與堿性磷酸酶活性顯著降低，表明此添加量下的醋酸棉酚已對異育銀鯽的健康造成了一定的負(fù)面影響，使機(jī)體代謝能力減弱或免疫調(diào)節(jié)功能下降。膽紅素是血液循環(huán)中衰老紅細(xì)胞在肝臟、脾臟及骨髓的單核－吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中分解的產(chǎn)物，在肝臟內(nèi)經(jīng)過葡萄糖醛酸化的叫做直接膽紅素，未在肝臟內(nèi)經(jīng)過葡萄糖醛酸化的叫做間接膽紅素，二者的總和就是總膽紅素［16］。若機(jī)體內(nèi)生成的膽紅素超過了肝細(xì)胞的處理能力，或者肝細(xì)胞的處理能力下降，以及膽紅素排泄障礙等均會使得血清中總膽紅素含量升高。本試驗中，血清總膽紅素含量隨著飼料中醋酸棉酚添加量的增加呈升高趨勢，說明飼料中醋酸棉酚的增加可能導(dǎo)致了肝細(xì)胞處理膽紅素能力的減弱。

腎臟受損和腎功能降低時，會引起多種化學(xué)成分如尿素、肌酐、尿酸等物質(zhì)在血液中沉積，產(chǎn)生多種疾病，因此肌酐和尿素是反映腎功能的重要指標(biāo)。本試驗中，異育銀鯽的血清肌酐和尿素含量隨著醋酸棉酚添加量的增加而升高，表明魚體腎功能可能受到了一定程度的損傷。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽的血清總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖和鈣含量在各組間無顯著變化，說明900 mg/kg添加量的醋酸棉酚并未影響機(jī)體的糖類和脂類代謝。

3.3 醋酸棉酚對異育銀鯽棉酚殘留的影響

游離棉酚被動物攝入后，大部分在消化道中形成結(jié)合棉酚經(jīng)糞便排出，小部分被吸收，主要分布于肝臟、腎臟和肌肉組織中，尤以肝臟中含量最高。Roehm 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，用含250 mg/kg游離棉酚的飼料喂養(yǎng)虹鱒18個月，其肝臟游離棉酚含量較低，而當(dāng)飼料游離棉酚含量為1 000 mg/kg時，其肝臟游離棉酚含量顯著增加;Mediha等［12］報道，隨著飼料中醋酸棉酚含量的增加，斑點(diǎn)叉尾肝臟游離棉酚含量呈線性增加，醋酸棉酚添加量為1 500 mg/kg時，肝臟游離棉酚含量為1 066.06 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ));作者前期的研究表明，隨著飼料中棉籽粕的用量從0增加到60%(游離棉酚含量從 0mg/kg增加到260.57 mg/kg)，異育銀鯽肌肉和肝臟游離棉酚含量由0 mg/kg分別增加到36.04和409.39 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))［13］。本試驗中，隨著醋酸棉酚添加量的增加，異育銀鯽的肌肉和肝臟游離棉酚含量也顯著增加，但并沒有出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，表明異育銀鯽對游離棉酚有較強(qiáng)的耐受力。從本試驗結(jié)果還可以看出，肝臟是游離棉酚殘留的主要器官，殘留量相對較大，而游離棉酚在肌肉中的殘留量相對較低。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，棉籽粕在草食性、雜食性魚類配合飼料中的用量一般為20% ～30%，游離棉酚在肌肉中的殘留量不會太高，但從品質(zhì)安全的因素考慮，商品魚在上市前應(yīng)飼以不含棉籽粕的飼料或停喂一段時間，以促進(jìn)魚體對游離棉酚的代謝，降低肌肉游離棉酚含量。

4 結(jié)論

本試驗條件下，當(dāng)飼料中醋酸棉酚添加量達(dá)300 mg/kg時，異育銀鯽的生長性能降低，組織中棉酚殘留量增加;當(dāng)飼料中醋酸棉酚添加量達(dá)900 mg/kg時，異育銀鯽的肝功能和腎功能還會受到損傷。

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