張 英，朱 穎，姚 拓

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 草業(yè)科學(xué)系，青海 西寧 810016）

植物根際中存在著大量的能夠溶解磷礦粉的微生物［1－4］。長期以來，國內(nèi)外的學(xué)者對溶磷微生物的種類和能力開展了廣泛的研究［5－11］，取得了一些開拓性成果，但多年的實(shí)踐結(jié)果也表明，溶磷微生物的實(shí)際應(yīng)用效果并不理想，很多菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)出明顯溶磷能力，但應(yīng)用到田間溶磷效果卻不明顯，難以適應(yīng)不同的生長環(huán)境［12，13］。所以，從特定地區(qū)和植物根際篩選溶磷、適應(yīng)能力強(qiáng)，兼有其他優(yōu)良特性的菌株有著重要的意義。

白三葉（Trifolium repens）和紅三葉（Trifolium pratense）為豆科車軸草屬［14］多年生牧草。紅三葉是優(yōu)質(zhì)的多年生牧草，同時(shí)又是良好的蜜源植物及綠肥植物，是優(yōu)良的園林綠化及水土保持植物資源，植株中富含異黃酮類化合物，具有抗腫瘤（胃癌、乳腺癌），防治骨質(zhì)疏松、改善更年期綜合癥等作用［15］，是一種極有開發(fā)前景的天然藥材，是園林綠化、水土保持和水源涵養(yǎng)地建設(shè)的優(yōu)良草本植物。

目前，有關(guān)車軸草屬植物根際溶磷菌的研究報(bào)道較少。對分離自白三葉和紅三葉草根際的10株溶磷細(xì)菌的溶磷能力和分泌IAA能力進(jìn)行測定，篩選優(yōu)良菌株，為溶磷菌菌株特性的研究和菌肥的開發(fā)利用提供優(yōu)良用菌株資源。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試菌株為前期［16－18］在蘭州、定西、酒泉地區(qū)白三葉和紅三葉根際分離、篩選獲得的10株溶磷細(xì)菌（菌株編號為：ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－12、ls2－16、ls3－1、ls3－2、ls3－5、lhs11、lhs4）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基［19］，PKO 無機(jī)磷培養(yǎng)基［20］，蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基［17］，King培養(yǎng)基［21］，Spot比色液和 S2比色液［22］。

1.3 溶磷能力測定

1.3.1 定性測定 將LB斜面培養(yǎng)基中保存的菌株，活化后點(diǎn)接種于PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，第10d后觀察、測量各菌株形成的溶磷圈大小。根據(jù)溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值（D/d）初步確定菌株溶磷能力。

1.3.2 定量測定 將50mL液體PKO無機(jī)磷（或蒙金娜有機(jī)磷）培養(yǎng)基裝入150mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后，分別將500μL各待測菌株的菌懸液（108cfu/mL）接種至三角瓶中。每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對照。將上述三角瓶置于28℃、160r/min搖床培養(yǎng)10d后，用酸度計(jì)測定培養(yǎng)液pH值。將培養(yǎng)液10 000r/min、4℃離心15 min，取上清液，用鉬銻抗比色法測定有效磷增量（扣除對照后的值（mg/L））［23］。

1.4 分泌IAA能力測定

1.4.1 定性測定 將50mL液體King培養(yǎng)基裝于150mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后分別將500 μL各待測菌株菌懸液（108cfu/mL）接種至三角瓶中。每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對照。將三角瓶置于28℃，129r/min搖床培養(yǎng)12d，取菌株懸浮液50μL滴置于白色陶瓷板上，同時(shí)加50 μL Spot比色液，對照只在比色液中加50μL 10mg/L的植物生長激素（3－吲哚乙酸）；將白色瓷板置室溫下，在15min內(nèi)觀察其顏色變化，顏色變粉紅者表示能分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA能力越強(qiáng)；不變色為陰性，即不分泌IAA［22］。

1.4.2 定量測定 取上述培養(yǎng)12d的培養(yǎng)液10 000 r/min、4℃離心10min，取上清液1mL加1mL S2比色液在黑暗下靜置30min，迅速用分光光度計(jì)比色（波長530nm）［22］，標(biāo)準(zhǔn)曲線用純3－吲哚乙酸制作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷能力的測定

溶磷圈直徑（D）、菌落生長直徑（d）及比值（D/d）是表征溶磷菌相對溶磷能力的一個(gè)指標(biāo)，可初步確定溶磷菌株的溶磷效果。對各菌株在PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10d，用溶磷圈法分別測定了各菌株的D/d值（圖1、2），結(jié)果表明，各菌株的D/d值大小差異顯著（P＜0.05）。在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52，其中，菌株ls1－3的 D/d 值 （1.52）最大，菌 株ls3－2 的 D/d 值（1.07）最小，菌株ls2－11，ls2－16和ls3－2的溶磷透明圈不明顯。在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45，其中，菌株lhs1的D/d值（1.45）最大，菌株ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－13的 D/d值為1，并發(fā)現(xiàn)各菌株無明顯的溶磷透明圈。

圖1 菌株在PKO培養(yǎng)基上的D/dFig.1 D/d vallue in PKO culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

圖1 菌株在蒙金娜培養(yǎng)基上的D/dFig.2 D/d vallue in Mongoli culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

溶磷圈法只能定性測定各菌株溶磷能力。為進(jìn)一步測定各菌株溶磷性強(qiáng)弱，將各菌株單獨(dú)接種于PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中10d后測定各上清液有效磷增量，結(jié)果各菌株都具有溶解磷酸三鈣能力（表1），并且差異顯著（P＜0.01）。各菌株在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)液中有效磷增量在106.63～666.01 mg/L，其中，菌株ls1－3有效磷增量最大，有效磷增量大于 500mg/L 的菌株有 4 株（ls1－3、1s1－5、ls2－13、lhs4），占溶磷細(xì)菌總數(shù)40%。各菌株在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量（58.42mg/L）最大，菌株lhs4有效磷增量（35.08mg/L）次之，有效磷增量小于3mg/L的菌株有4株（ls2－11、1s2－13、ls2－16、ls3－2），并有2株菌株（ls1－3、1s1－5）不表現(xiàn)溶磷有機(jī)磷的能力。各菌株對不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為179.11 mg/L），又能溶解有機(jī)磷（蒙金娜培養(yǎng)液的有效磷增量為58.42mg/L），但溶磷的能力差異較大；菌株ls2－13溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為593.52 mg/L）的能力較強(qiáng)，但溶解有機(jī)磷（蒙金娜培養(yǎng)液的有效磷增量為0.46mg/L）的能力較弱；菌株ls1－3溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為666.01mg/L）的能力很強(qiáng)，但無溶解有機(jī)磷的能力。

表1 各菌株在PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量Table 1 Available phosphorus increased on PKO and MENG Jin－na culture medium

2.2 分泌IAA能力測定

各菌株用King培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)12d，定性和定量測定各菌株IAA的能力，結(jié)果表明，各菌株IAA的能力和數(shù)量差異顯著（P＜0.01）（表2）。測試菌株中7個(gè)菌株具有IAA的能力，占供試菌株數(shù)的70%，分泌量在0.36～20.39mg/L，其中l(wèi)s3－5分泌能力最強(qiáng)，分泌量（20.39μg/mL）也最大。而菌株ls2－16，ls3－2和ls2－11均無分泌IAA的能力。定性測定中，若顯色反應(yīng)顏色越深，說明菌株分泌IAA能力越強(qiáng)，反之越弱；若無顏色反應(yīng)，說明這些菌株沒有分泌IAA能力。為進(jìn)一步確定各菌株分泌IAA的能力，又進(jìn)行了S2法比色定量測定，測定的結(jié)果與定性測定結(jié)果一致。

表2 溶磷菌King培養(yǎng)基中分泌IAA量Table 2 Concentration of IAA secreted by phosphatesolubilizing bacteria in King culture medium

3 討論

植物根際存在很多種溶磷菌，但各菌株的溶磷能力有較大的差異。尹瑞林［24］從土壤中分離出的265株細(xì)菌的溶磷能力平均為每克土壤溶磷2～30mg，其中，巨大芽孢桿菌、節(jié)細(xì)菌、黃桿菌、歐文氏菌及假單胞菌的溶磷能力較強(qiáng)，其次為產(chǎn)堿菌、多黏芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。Sundara等［25］利用磷酸三鈣為磷源，經(jīng)過14d的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和埃希氏菌的溶磷能力較強(qiáng)。隨后，Paul和Sundara［26］進(jìn)一步測定從豆科植物根際分離出來的12種芽孢桿菌溶解磷酸三鈣的能力，發(fā)現(xiàn)雖然是相同屬的細(xì)菌，但是Bacillus meaateriu的溶磷能力明顯高于Bacillus brevise。林啟美等［27］測定假單胞菌屬培養(yǎng)7d時(shí)溶磷圈D/d值1.00～3.50；芽孢桿菌屬培養(yǎng)7d溶磷圈的D/d值1.14～1.43；另外，發(fā)現(xiàn)以磷礦粉為唯一磷源培養(yǎng)解磷細(xì)菌，5d后培養(yǎng)液中可溶性磷的含量最高為117.3mg/L。馮瑞章等［28］測定定西苜蓿根際溶磷細(xì)菌菌株Dm84培養(yǎng)8d后，有效磷增量為227.1mg/L。Kobus［29］研究認(rèn)為菌株D/d值的變化不僅與時(shí)間有關(guān)系，還與菌株代謝物種類、釋放快慢及代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基上的蔓延程度等有關(guān)。此次研究測定供試菌株的溶磷能力差異較大，在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52；在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45。各菌株在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在106.63～666.01mg/L，菌株ls1－3有效磷增量最大；各菌株在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量最大。各菌株對不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解無機(jī)磷，又能溶解有機(jī)磷，但溶磷的能力差異較大；菌株ls2－13溶解無機(jī)磷的能力較強(qiáng)，但溶解有機(jī)磷的能力較弱；菌株ls1－3溶解無機(jī)磷的能力很強(qiáng)，但無溶解有機(jī)磷的能力。溶磷能力首先取決于菌株本身的特性，另外，菌株的溶磷機(jī)理也非常復(fù)雜［30－32］，如分泌質(zhì)子、有機(jī)酸和其他物質(zhì)的數(shù)量和種類，其次，與難溶性磷酸鹽的結(jié)構(gòu)和組成成分有關(guān)系，本研究各菌株的溶磷機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

植物根際的很多菌株都具有分泌植物生長激素（IAA）能力［33，34］，分泌量差異較大。Malik等［35］用比色法測定了巴基斯坦鹽堿地小麥等植物根際固氮菌株分泌IAA能力，其在5.11～35.70mg/L。本研究各菌株IAA能力進(jìn)行定性和定量測定結(jié)果一致，各菌株分泌IAA量在0.36～20.39mg/L，略低于 Malik的測定結(jié)果。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與菌株種類、生理和生態(tài)特性及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。比色法只是初步定量研究菌株分泌IAA范圍，若要準(zhǔn)確反映各菌株分泌IAA含量，需進(jìn)一步測定。

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