邵 杰，羅建光，曾曉雄,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

液體培養(yǎng)的桑黃胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

邵 杰1,2，羅建光1，曾曉雄1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

通過27-3IV部分因子設(shè)計(FFD)，對葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養(yǎng)因子進(jìn)行篩選。在此基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計對部分因子設(shè)計，篩選出對桑黃胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，確定培養(yǎng)基的

鮑氏層孔菌；胞外多糖；部分因子設(shè)計；中心組合設(shè)計

鮑氏層孔菌(Phellinus baumii Pilát)是重要的藥用真菌，其子實體俗稱桑黃。桑黃多糖是桑黃的主要藥效成分之一，具有提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤、降血糖、抗糖尿病等多方面的生物活性和藥理作用[1-7]。

傳統(tǒng)上，鮑氏層孔菌的活性成分多糖通常從子實體中提??；但由于鮑氏層孔菌野生資源(子實體)的日益匱乏，加之人工栽培周期長、難度較大，這已限制了對桑黃的進(jìn)一步開發(fā)和利用。而液體深層發(fā)酵具有周期短、多糖產(chǎn)量高、條件控制容易、污染少、便于發(fā)酵下游加工處理以及工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點，是大量獲取活性多糖的理想途徑，因而通過液體發(fā)酵制備桑黃多糖備受關(guān)注[8-11]。然而，培養(yǎng)條件是液體發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素。目前尚沒有關(guān)于采用數(shù)理統(tǒng)計方法優(yōu)化鮑氏層孔菌胞外多糖培養(yǎng)條件的報道。為此，本研究采用部分因子設(shè)計(FFD)和響應(yīng)曲面中的中心組合設(shè)計(CCD)，以桑黃胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，對鮑氏層孔菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期篩選出能高產(chǎn)鮑氏層孔菌多糖的培養(yǎng)基成分，為進(jìn)一步開發(fā)鮑氏層孔菌資源提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鮑氏層孔菌(P.baumii Pilát)購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

斜面培養(yǎng)基：綜合PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、酵母膏1、KH2PO41、MgSO40.5、VB10.01，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：按照實驗設(shè)計配制。

1.2 菌種培養(yǎng)及接種

取活化后的斜面試管菌種接入盛有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，按照實驗設(shè)計，采用不同的培養(yǎng)基在溫度為28℃、pH值為6.0以及培養(yǎng)時間為5d的條件下，置往復(fù)式搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 胞外多糖的制備

培養(yǎng)結(jié)束后，不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵醪液在5000r/min進(jìn)行離心20min，上清液經(jīng)濾紙過濾后，濃縮至原體積的1/3，在4℃條件下用75%乙醇沉淀、過夜，經(jīng)離心得到的沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次、干燥，得到桑黃胞外粗多糖[12]。采用苯酚-硫酸法測定胞外總糖含量。采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸法)測定還原糖含量。桑黃多糖的產(chǎn)量以每升發(fā)酵醪液中胞外多糖(EPS)的干質(zhì)量進(jìn)行計算，單位為g/L。

胞外多糖含量=胞外總糖含量ˉ胞外還原糖含量

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)藥用真菌生長所需營養(yǎng)要素的基本原則以及藥用真菌發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合近期的相關(guān)文獻(xiàn)報道[13-14]以及前期單因素試驗，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養(yǎng)因子進(jìn)行考察，其優(yōu)化步驟包括兩個階段：1)通過27-3IV部分因素設(shè)計(FFD)，對7個變量進(jìn)行篩選，確定影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素；2)采用響應(yīng)曲面設(shè)計中的中心組合設(shè)計對部分因素設(shè)計篩選出的有顯著影響胞外多糖產(chǎn)量的因素水平進(jìn)行優(yōu)化，最終確定培養(yǎng)基的組成和水平。采用Stat-Ease Design-Expert軟件(version7.1.3, Stat-Ease Corporation, USA)和SAS statistical package (Version 8.1, SAS Institute Inc., NC, USA)進(jìn)行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及模型的建立。

1.4.1 部分因子設(shè)計

選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨(C2H8N2O4)7個營養(yǎng)因子及其編碼水平設(shè)計見表1。

表1 27-3IV部分因子試驗設(shè)計因素編碼及水平Table 1 Coded and real values of the variables tested in 27-3IV fractional factorial design

1.4.2 中心組合設(shè)計

通過27-3IV部分因子設(shè)計，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酵母膏和草酸銨是影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。采用全因素中心組合試驗設(shè)計對影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的培養(yǎng)基關(guān)鍵組成成分及其最佳水平進(jìn)行探索。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因子設(shè)計及關(guān)鍵因子的確定

27-3IV部分因子設(shè)計見表2，包括16個試驗點和4個重復(fù)的中心點，在發(fā)酵培養(yǎng)6d、pH6.0、培養(yǎng)溫度28℃的條件下，測定其響應(yīng)值桑黃胞外多糖產(chǎn)量。

表2 部分因子試驗設(shè)計及結(jié)果(n＝2)Table 2 27-3IV fractional factorial design and experiments results(n＝2)

在前期實驗工作的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養(yǎng)因子進(jìn)行主因素分析。從表2可以看出，在不同的培養(yǎng)基成組合情況下，胞外多糖產(chǎn)量在0.59～2.38g/L之間變化。

表3 部分因子設(shè)計試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析Table 3 Statistical analysis of the experimental results of 27-3IV fractional factorial design

對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)，所選用的模型具有高度的顯著性(P=0.0314)，其校正相關(guān)系數(shù)R2=90.28%，表明此模型擬合度較好，所研究的7個因子僅有9.72%的桑黃胞外多糖產(chǎn)量總變異不能夠用此模型來解釋，表明該模型適合解釋和預(yù)測桑黃胞外多糖產(chǎn)量。該模型回歸系數(shù)顯著性檢驗表明葡萄糖(P=0.0111)、酵母膏(P=0.0381)、草酸銨(P=0.0115)、葡萄糖與酵母膏(P=0.0498)、葡萄糖與草酸銨(P=0.0179)、葡萄糖、蛋白胨與磷酸二氫鉀(P=0.0107)的交互作用對桑黃胞外多糖產(chǎn)量有顯著影響。因此，葡萄糖、酵母膏和草酸銨3個培養(yǎng)基成分被確定為影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

2.2 中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析

根據(jù)部分因子設(shè)計的試驗結(jié)果，在中心組合設(shè)計試驗中，3個關(guān)鍵因素代碼及其中心點分別為葡萄糖(X1) 30g/L、酵母膏(X2) 4.5g/L、草酸銨(X3) 1.0g/L，而蛋白胨、硫酸鎂、KH2PO4和VB1等4個因素在FFD試驗統(tǒng)計分析中，在5%置信度上沒有顯著性，作為常量對待，取中間水平值分別為4、0.75、1g/L和0.0075g/L。

表4 中心組合試驗設(shè)計及其響應(yīng)值(n＝2)Table 4 Central composite experimental design and results(n＝2)

表4列出三因素五水平的中心組合試驗設(shè)計及其響應(yīng)值，包括20個試驗點和6個重復(fù)的中心點，發(fā)酵培養(yǎng)6d、pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為28℃。表中自變量編碼方程為：χi=(XiˉX0)/ΔXi，式中χi為自變量編碼值，Xi為自變量水平實際值，X0為實驗水平中心點實際值，ΔXi表示各變量實際值與中心點值之差。運用Design Experts 7.1.3軟件和SAS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，根據(jù)以式(1)擬合出二次多元回歸模型：

式中：Y為鮑氏層孔菌胞外多糖產(chǎn)量；β0、βi、βii、 βij分別表示常數(shù)項、一次項、二次項和交互項的系數(shù)；Xi、Xj表示兩個不同的變量(i≠j)。模型方程的擬合性質(zhì)由決定系數(shù)R2及方差分析判定，統(tǒng)計顯著性和回歸系數(shù)顯著性進(jìn)行F檢驗來檢測，P值取0.05、0.01兩個不同水平。

根據(jù)CCD試驗設(shè)計原理，利用Design Expert 7.1.3軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，以Y代表桑黃胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，回歸方程為：

由表5可見，該回歸模型(P=0.0024)高度顯著，失擬項(P=0.3507)不顯著，表明該模型適合解釋和預(yù)測桑黃胞外多糖產(chǎn)量；而且模型的一次項(X1、X2、X3)、平方項(X12、X22、X32) 和交互項(X1X3)是顯著的。其校正相關(guān)系數(shù)R2=0.7458，說明由這3個因子及其二次項能解釋桑黃胞外多糖產(chǎn)量總變異的74.58%，模型擬合程度較好，可以利用該回歸方程確定最優(yōu)的產(chǎn)桑黃胞外多糖的培養(yǎng)基成分。

表5 多元回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis for the established regression model

通過桑黃胞外多糖產(chǎn)量回歸模型方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖1～3，通過該組圖即可直觀地評價出因素對桑黃胞外多糖產(chǎn)量影響的兩兩交互作用以及確定各個因素的最佳水平范圍。

圖1 葡萄糖和酵母膏交互影響EPS產(chǎn)量的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.1 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and yeast extract concentrations on EPS production (C2H8N2O4 concentration = 1 g/L)

圖1 顯示了草酸銨質(zhì)量濃度1g/L時，葡萄糖和酵母膏對桑黃胞外多糖產(chǎn)量的效應(yīng)。葡萄糖既是菌體生長的碳源和能源，同時又是產(chǎn)物EPS重要組成成分。葡萄糖在培養(yǎng)基中具有重要作用，其質(zhì)量濃度的變化直接影響EPS產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度較高時，胞外多糖產(chǎn)量隨著酵母膏質(zhì)量濃度的增加而降低，這可能是由于較高質(zhì)量濃度碳氮源導(dǎo)致太高的滲透壓，不利于菌體生長有關(guān)；而在低質(zhì)量濃度時，EPS產(chǎn)量隨著酵母膏質(zhì)量濃度的增加而增加。此外，等高線圖的形狀直接反應(yīng)交互作用的強(qiáng)弱[15]。從葡萄糖和酵母膏交互作用的等高線圖c可以看出，二者之間存在一定的交互作用，但在P = 0.05水平上沒有差異顯著性。

當(dāng)酵母膏4.5g/L時，葡萄糖和草酸銨對桑黃胞外多糖產(chǎn)量的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線圖見圖2。在低水平的葡萄糖質(zhì)量濃度時(20～30g/L)，EPS產(chǎn)量隨草酸銨質(zhì)量濃度的增加而增加；高水平的葡萄糖質(zhì)量濃度時(30～40g/L)，EPS產(chǎn)量隨草酸銨質(zhì)量濃度的增加而降低。葡萄糖和草酸銨交互作用的等高線圖呈橢園形，具有較強(qiáng)的交互影響。同時，高質(zhì)量濃度的碳氮源增加了培養(yǎng)基的滲透壓，造成菌體生長遲緩或停滯，進(jìn)而降低了EPS產(chǎn)量。

圖2 葡萄糖和草酸銨交互影響EPS產(chǎn)量的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.2 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and C2H8N2O4 concentrations on EPS production ( yeast extract concentration = 4 g/L)

葡萄糖的質(zhì)量濃度處于40g/L時，酵母膏和草酸銨對桑黃胞外多糖產(chǎn)量的交互作用影響的響應(yīng)曲面圖和等高線見圖3。氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，是微生物生長繁殖所需的主要營養(yǎng)物。前期的研究發(fā)現(xiàn)酵母膏和草酸銨分別是產(chǎn)胞外多糖的鮑氏層孔菌液體發(fā)酵重要有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。由圖3可見，酵母膏的質(zhì)量濃度處于低水平時(3.0～4.5g/L)，胞外多糖產(chǎn)量隨著草酸銨的質(zhì)量濃度增加而增加。當(dāng)酵母膏的質(zhì)量濃度處于較高水平時(4.5～6.0g/L)，隨著草酸銨的質(zhì)量濃度增加，胞外多糖產(chǎn)量反而下降。這可能與酵母膏營養(yǎng)成分復(fù)雜、酵母膏與草酸銨的濃度過高，培養(yǎng)基組成的C/N比過低，培養(yǎng)基的滲透壓過高，造成菌體對氮源利用程度下降，不利于菌體生長代謝，從而導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量降低。此外，酵母膏和草酸銨交互作用的等高線圖亦呈橢圓形，也具有較強(qiáng)的交互影響。

圖3 酵母膏和C2H8N2O4交互影響EPS產(chǎn)量的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.3 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast extract and C2H8N2O4 concentrations on EPS production (glucose concentration = 30 g/L)

由圖1～3可知，3個響應(yīng)曲面圖均存在極值點，對二次多元回歸方程(2)求極大值，即得桑黃胞外多糖產(chǎn)量的預(yù)測值為2.342g/L。對應(yīng)的3個因素：葡萄糖、酵母膏和草酸銨的代碼值分別為0.41、0.34、ˉ0.23；相應(yīng)的最佳質(zhì)量濃度分別為：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、草酸銨0.88g/L。

為驗證回歸模型的可靠性和響應(yīng)曲面的分析結(jié)果，將響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到的培養(yǎng)基在相同的發(fā)酵條件下進(jìn)行5次平行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃胞外多糖平均產(chǎn)量為(2.363 ± 0.04)g/L，與預(yù)測值(2.342g/L)吻合度較高。由此可見，用該回歸模型優(yōu)化產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基成分是可行的。

應(yīng)用部分因子設(shè)計(FFD)和中心組合試驗設(shè)計(CCD)方法，優(yōu)化了鮑氏層孔菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基。結(jié)果表明，在所選取的7個影響因素中，僅葡萄糖、酵母膏以及草酸銨3個因素的可信度＞95%，是影響胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。進(jìn)一步的響應(yīng)面分析表明，在上述自變量分別為：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸銨0.88g/L時，桑黃胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值(2.363±0.04)g/L。

3 結(jié) 論

本研究首先利用部分因子設(shè)計，對影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的諸多相關(guān)因子進(jìn)行了評價，成功的篩選出影響胞外多糖產(chǎn)量的主要影響因素，省時省力，快速有效。通過響應(yīng)面中的中心組合設(shè)計建立了關(guān)鍵影響桑黃胞外多糖產(chǎn)量的二次多項數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計學(xué)方法對該模型進(jìn)行了顯著性檢驗，優(yōu)化了因素水平，探討了各因素間的交互作用。通過對模型方程的3-D圖及其等高線圖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，桑黃胞外多糖平均產(chǎn)量為(2.363 ± 0.04)g/L，與預(yù)測值(2.342g/L)吻合度較高。由此可見，將部分因子設(shè)計和響應(yīng)面中的中心組合設(shè)計相結(jié)合優(yōu)化微生物發(fā)酵條件是一種十分有效的方法。

[1]HWANG H J, KIM S W, LIM J M, et al. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Life Science, 2005, 76(26): 3069-3080.

[2]KIM H M, HAN S B, OH G T, et al. Stimulation of humoral and cell meditated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteus [J]. International Journal of Immunopharmacology, 1996, 18(5): 295-303.

[3]KIM H Y, YOON D H, LEE W H, et al. Phellinus linteus inhibits inflammatory mediators by suppressingredox-based NF-κB and MAPKs activation in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophage[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2007, 114(3): 307-315.

[4]池玉杰, 潘學(xué)仁. 7種木層孔菌屬真菌的培養(yǎng)特性[J]. 菌物系統(tǒng), 2001, 20(3): 379-380.

[5]國家衛(wèi)生部和國家中醫(yī)藥管理局. 中華本草: 第一卷[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1999.

[6]駱冬青, 鄭紅鷹, 汪維云. 珍稀藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2008, 15(1): 76-78.

[7]戴玉成. 藥用擔(dān)子菌: 鮑氏層孔菌(桑黃)的新認(rèn)識[J]. 中草藥, 2003, 34(1): 94.

[8]CHO Y J, HWANG H J, KIM S W, et al. Effect of carbon source and aeration rate on broth rheology and fungal morphology during red pigment production by Paecilomyces sinclairri in a batch bioreactor[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 95: 13-23.

[9]PARK J P, KIM Y M, KIM S W, et al. Effect of aeration rate on the mycelial morphology and exo-biopolymer production in Cordyceps militaris[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(11): 1257-1262.

[10]SINHA J, BAE J T, PARK J P, et al. Changes in morphology of Paecilomyces japonica and its effect on broth rheology during production of exo-biopolymers [J]. Applied Microbiol Biotechnology, 2001, 56(1/2): 88-92.

[11]LEE B C, BAE J T, PYO H B, et al. Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible Basidiomycete Grifola frondosa[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(5): 369-376.

[12]YANG Xiaotong, WAN J M F, MI Ke, et al. The quantification of (1,3)-β-glucan in edible and medicinal mushroom polysaccharides by using limulus G test[J]. Mycosystema, 2003, 2: 296-302.

[13]CHEN Wei, ZHAO Zhao, CHEN Shifen, et al. Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(8): 3187-3194.

[14]MAO X B, EKSRIWONG T, CHAUVATCHARIN S, et al. Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris [J]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): 1667-1672.

[15]MURALIDHAR R V, CHIRUMAMILA R R, MARCHANT R, et al. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J]. Biochemical Engineering Journal, 2001, 9(1): 17-23.

Optimization of Cultivation Conditions for Extracellular Polysaccharide Production by P. baumii Pilát

SHAO Jie1,2，LUO Jian-guang1，ZENG Xiao-xiong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

A 27ˉ3IVfractional factorial design (FFD) was employed to determine culture medium ingredients affecting extracellular polysaccharide (EPS) production by P. baumii Pilát, such as glucose, peptone, yeast extract, ammonium oxalate, KH2PO4, MgSO4 and thiamine (VB1). Glucose, yeast extract and ammonium oxalate were identified as key affecting factors, and their optimal levels were further investigated by means of a central composite design. The average EPS yield from 5 parallel fermentation experiments carried out using a culture medium (g/L) composed of glucose 34.12, yeast extract 5.01, peptone 4, MgSO40.75, KH2PO41, VB10.0075 and ammonium oxalate 0.88 was (2.363 ± 0.04)g/L, which was in substantial agreement with the predicted value (2.342 g/L). It can be seen clearly that the developed regression model is applicable for the optimization of culture medium for EPS production.

Phellinus baumii Pilát；extracellular polysaccharide；fractional factorial design；central composite design

TQ920.4

A

1002-6630(2012)03-0121-05

2011-05-01

安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究項目(KJ2009B076)

邵杰(1968—)，男，講師，碩士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：shaoj9099@163.com

*通信作者：曾曉雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向為糖生物學(xué)與糖生物工程、酶工程、天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn

組成和水平。在葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸銨0.88g/L的條件下進(jìn)行5次平行發(fā)酵實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃胞外多糖平均產(chǎn)量為(2.363±0.04)g/L，與預(yù)測值(2.342g/L)基本相符?？梢姡迷摶貧w模型優(yōu)化產(chǎn)桑黃胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基是可行的。