王翠翠，郭宇星,*，潘道東,2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶的條件研究

王翠翠1，郭宇星1,*，潘道東1,2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用交聯(lián)-吸附法對(duì)瑞士乳桿菌蛋白酶的固定化條件進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以固定化酶活力為主要指標(biāo)，研究凝結(jié)液、殼聚糖質(zhì)量濃度、酶用量、交聯(lián)時(shí)間、戊二醛質(zhì)量濃度對(duì)瑞士乳桿菌蛋白酶固定化的影響。運(yùn)用響應(yīng)面對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定瑞士乳桿菌蛋白酶的最優(yōu)固定條件：凝結(jié)液為4g/100mL NaOH-甲醇(體積比3:1)、殼聚糖質(zhì)量濃度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交聯(lián)時(shí)間1h、戊二醛質(zhì)量濃度0.40g/100mL，此時(shí)固定化酶活力為28.67U。

瑞士乳桿菌蛋白酶；固定化；酶活力

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)采用某些瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的發(fā)酵乳有較強(qiáng)的降高血壓功能，主要是因?yàn)槿鹗咳闂U菌的蛋白酶可分解乳蛋白產(chǎn)生多肽，這些多肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE)[1]具有抑制作用，從而可降低人體血壓。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I converting enzyme，EC3.4.15.1)抑制肽是一類(lèi)具有抑制ACE活性的肽類(lèi)物質(zhì)，這些多肽具有降血壓的功能[2]。在瑞士乳桿菌蛋白酶研究方面，Guo Yuxing[3-4]、Yamamoto[5]、Fang[6]、Coolbear[7]等對(duì)細(xì)胞壁蛋白酶的純化、反應(yīng)條件、特異性、生產(chǎn)利用及穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究。郭宇星等[8]從瑞士乳桿菌ATCC15019發(fā)酵乳及其胞內(nèi)粗提物水解脫脂乳的水解液中分離到具有較強(qiáng)ACE抑制活性和降高血壓功能的活性肽Ile-Pro-Pro (IPP)和Val-Pro-Pro (VPP)。

利用瑞士乳桿菌蛋白酶能水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽，但采用游離瑞士乳桿菌蛋白酶存在以下不足之處：酶解產(chǎn)物與蛋白酶分離困難，增加分離提純成本；蛋白酶穩(wěn)定性不好，保存不好易失活；蛋白酶不能回收重復(fù)利用等。這一系列弊端，會(huì)導(dǎo)致ACE抑制肽的生產(chǎn)成本較高，制約ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)。所以如果能利用固定化瑞士乳桿菌蛋白酶[9-10]水解乳蛋白，將可以實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用。本研究采用殼聚糖[11]固定化瑞士乳桿菌蛋白酶，并利用響應(yīng)面法進(jìn)行固定化條件的優(yōu)化研究，旨在為ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑞士乳桿菌15019(Lactobacillus helveticus 15019) 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA (MS-Arg)美國(guó)MP Biomedicals公司合成；乙酸、殼聚糖、戊二醛 南京生興生物技術(shù)有限公司；其他試劑均購(gòu)自上海久億化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVY220電子天平 日本Shimadzu公司；YXQ-LS-50SII高壓滅菌鍋 西安常儀儀器設(shè)備有限公司；LRH-250A恒溫培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；A1301019低溫高速離心機(jī)、A1801023恒溫勻速搖床 上海艾測(cè)電子科技有限公司；SL-900D超聲波破碎儀 南京順流儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、磁力攪拌器 南京智拓儀器儀表有限公司；HI9124N pH測(cè)定儀 上海米聯(lián)電子科技有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌蛋白酶的提取

瑞士乳桿菌菌體凍干粉(ˉ80℃冷藏)接種于MRS培養(yǎng)基，連續(xù)活化3代，按3%接種量接種于1L MRS培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期取出，4℃、4500r/min離心20min收集菌體沉淀。用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液洗滌菌體，4℃、4500r/min離心20min，棄上清，重復(fù)洗滌3次，收集菌體備用。

采用超聲波破碎法提?。簻?zhǔn)確稱取菌體2g，用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)10mL重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300W、破碎時(shí)間3s、間隔時(shí)間5s、破碎200次。取破碎液4℃、4500r/min離心20min，取上清液即為粗酶液。

1.3.2 固定化瑞士乳桿菌蛋白酶活力測(cè)定

以MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA (MS-Arg)為底物，配成16.4mmol/L。取0.05mL底物，1g殼聚糖固定化瑞士乳桿菌蛋白酶小球，2.85mL Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7.8)混合，在37℃條件下保溫60min。用0.5mL 30%乙酸終止反應(yīng)，于4℃、4500r/min離心20min，去除固定化小球后，取上清液在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白對(duì)照管：以蒸餾水代替酶液進(jìn)行同樣條件的操作。酶活力定義：37℃時(shí)，每小時(shí)吸光度上升0.01為一個(gè)活力單位(U)。

1.3.3 殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶

取一定量殼聚糖溶解于100mL水，攪拌10min，加1mL乙酸，攪拌3h后，4℃條件下過(guò)夜。配成一定質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液，然后用注射器分批加入到凝結(jié)液中，使凝結(jié)成中空球形殼聚糖，靜置3h。取一定量的中空球形殼聚糖，蒸餾水洗滌至中性，放入一定質(zhì)量濃度的戊二醛水溶液100mL中活化一定時(shí)間，再用蒸餾水洗滌至中性，制得經(jīng)過(guò)戊二醛活化的中空球形殼聚糖。分別取一定量的瑞士乳桿菌蛋白酶溶液加入到1g戊二醛活化的中空球形殼聚糖，室溫下攪拌反應(yīng)，于4℃靜置固定過(guò)夜，Tirs-HCl緩沖液(pH7.1)洗滌數(shù)次，除去游離蛋白酶，得到固定化蛋白酶[12]，按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定固定化瑞士乳桿菌蛋白酶的活力。

1.3.4 殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶單因素試驗(yàn)條件研究

1.3.4.1 凝結(jié)液的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度2.5g/100mL、戊二醛質(zhì)量濃度0.4g/100mL、戊二醛交聯(lián)時(shí)間2h、瑞士乳桿菌蛋白酶用量3mg的條件下，改變凝結(jié)液分別為：A液：15g/100mL NaOH-甲醇溶液體積比4:1；B液：4g/100mL NaOH-乙酸乙酯溶液體積比20:1；C液：4g/100mL NaOH-甲醇溶液體積比3:1；D液：20mg/mL三聚磷酸鈉，考察其對(duì)固定瑞士乳桿菌蛋白酶的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[13]。

1.3.4.2 戊二醛質(zhì)量濃度的影響

在凝結(jié)液4g/100mL NaOH-甲醇(體積比3:1)、殼聚糖質(zhì)量濃度2.5g/100mL、戊二醛交聯(lián)時(shí)間2h、瑞士乳桿菌蛋白酶用量3mg的條件下，改變戊二醛質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/100mL，考察其對(duì)固定瑞士乳桿菌蛋白酶的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[14]。

1.3.4.3 殼聚糖質(zhì)量濃度的影響

在凝結(jié)液4g/100mL NaOH-甲醇(體積比3:1)、戊二醛質(zhì)量濃度0.4g/100mL、戊二醛交聯(lián)時(shí)間2h、瑞士乳桿菌蛋白酶用量3mg的條件下，分別取殼聚糖1.5、2、2.5、3、3.5g，配成質(zhì)量濃度1.5、2、2.5、3、3.5g/100mL 5種質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液制備殼聚糖小球，考察其對(duì)固定瑞士乳桿菌蛋白酶的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[15]。

1.3.4.4 戊二醛交聯(lián)時(shí)間的影響

在凝結(jié)液4g/100mL NaOH-甲醇(體積比3:1)、殼聚糖質(zhì)量濃度2.5g/100mL、戊二醛質(zhì)量濃度0.4g/100mL、瑞士乳桿菌蛋白酶用量3mg的條件下，改變戊二醛交聯(lián)時(shí)間分別為1、2、3、4、5h，考察其對(duì)固定瑞士乳桿菌蛋白酶的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[16]。

1.3.4.5 酶用量的影響

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)瑞士乳桿菌蛋白酶液的蛋白含量，經(jīng)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)中加入相應(yīng)的酶量，使酶用量分別為1、2、3、4、5mg，在凝結(jié)液4g/100mL NaOH-甲醇(體積比3:1)、殼聚糖質(zhì)量濃度2.5g/100mL、戊二醛質(zhì)量濃度0.4g/100mL、戊二醛交聯(lián)時(shí)間2h的條件下，考察酶用量對(duì)固定瑞士乳桿菌蛋白酶的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[17]。

1.3.5 殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。以殼聚糖質(zhì)量濃度(X1)、酶用量(X2)、交聯(lián)時(shí)間(X3)、戊二醛質(zhì)量濃度(X4)為變量，展開(kāi)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。采用Design-Expert 7.1.3進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖凝結(jié)液的確定

圖1 不同凝結(jié)液對(duì)固定化蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of condensate on the activity of immobilized enzyme

15g/100mL NaOH-甲醇溶液(A液)：小球成型速度一般，呈規(guī)則小球狀，微透明純白色，加戊二醛交聯(lián)后呈淺黃色；4g/100mL NaOH-乙酸乙酯溶液(B液)：小球成型速度較慢，易黏連，呈微透明純白色，加戊二醛交聯(lián)后呈微黃色。4g/100mL NaOH-甲醇溶液(C液)：小球成型速度很快，呈規(guī)則小球狀，微透明純白色，加戊二醛交聯(lián)后呈淺黃色；20mg/mL三聚磷酸鈉(D液)：小球成型速度一般，呈規(guī)則小球狀，不透明純白色，加戊二醛交聯(lián)后呈淺褐色，易碎。由圖1可知，以4g/100mL NaOH-甲醇溶液(體積比3:1)為殼聚糖凝結(jié)液時(shí)，固定化蛋白酶的活性最高；從小球凝結(jié)狀態(tài)看出，此條件下小球成型速度很快，呈規(guī)則小球狀。因此，兼顧固定化蛋白酶活性以及殼聚糖凝結(jié)小球的狀態(tài)，選取4g/100mL NaOH-甲醇溶液(3:1)為殼聚糖小球凝結(jié)液。

2.2 戊二醛質(zhì)量濃度的確定

圖2 戊二醛質(zhì)量濃度對(duì)固定化蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme

由圖2可知，當(dāng)戊二醛質(zhì)量濃度低于0.4g/100mL，隨著戊二醛質(zhì)量濃度的增加，固定化酶活性增加，當(dāng)戊二醛質(zhì)量濃度高于0.4g/100mL時(shí)，固定化酶活性逐漸減小；當(dāng)戊二醛質(zhì)量濃度在0.4g/100mL時(shí)，固定化酶活性最高。隨著戊二醛質(zhì)量濃度的緩慢增加，殼聚糖分子中被活化的氨基數(shù)量不斷增多，大量的酶蛋白被固定到殼聚糖微球上，使得固定化蛋白酶的活性不斷增大；當(dāng)戊二醛質(zhì)量濃度達(dá)到0.4g/100mL時(shí)，足以使殼聚糖分子上及酶蛋白上的氨基充分交聯(lián)，固定化蛋白酶活性達(dá)到最大值；但隨著戊二醛質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增大，戊二醛對(duì)酶蛋白的變性作用增強(qiáng)，導(dǎo)致酶蛋白變性失活，使固定化蛋白酶活性降低。因此要得到較好的固定化效果，必須控制戊二醛質(zhì)量濃度適當(dāng)，本實(shí)驗(yàn)確定其質(zhì)量濃度為0.4g/100mL。

2.3 殼聚糖質(zhì)量濃度的確定

小球狀態(tài)：1.5g/100mL殼聚糖溶液，溶液較稀，小球呈半透明白色，顏色很淡；2g/100mL殼聚糖溶液，溶液稀薄度適中，小球呈微透明白色，顏色適中；2.5g/100mL殼聚糖溶液，溶液稀薄度適中，小球呈不透明白色；3g/100mL殼聚糖溶液，溶液較濃，小球呈不透明白色，溶液濃度較高，較難形成小球形狀；3.5g/100mL殼聚糖溶液，溶液很濃，小球呈不透明白色，溶液質(zhì)量濃度很高，幾乎無(wú)法形成小球。

由圖3可知，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為2g/100mL時(shí)，固定化蛋白酶的活性最高；從小球狀態(tài)可以看出，使用2g/100mL殼聚糖溶液時(shí)，凝結(jié)小球易成型。因此，兼顧固定化蛋白酶活性與小球的凝結(jié)狀態(tài)，選取質(zhì)量濃度為2g/100mL的殼聚糖溶液制作固定化小球。

圖3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)固定化蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of chitosan concentration on the activity of immobilized enzyme

2.4 戊二醛交聯(lián)時(shí)間的影響

圖4 戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of cross-linking time on the activity of immobilized enzyme

由圖4可知，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化蛋白酶活性由小變大，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為3h，固定化蛋白酶活性最大，達(dá)到24.7U。3h后，隨著交聯(lián)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，固定化蛋白酶活性有所下降，但趨于平緩。隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，戊二醛與殼聚糖二者的交聯(lián)反應(yīng)逐漸達(dá)到平衡，載體上的酶蛋白結(jié)合位點(diǎn)也不斷被飽和，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間進(jìn)一步增加時(shí)，固定到載體上的酶蛋白的量基本恒定。因此合理控制交聯(lián)時(shí)間也比較重要，本實(shí)驗(yàn)最終確定交聯(lián)時(shí)間3h為宜。

2.5 酶用量的影響

圖5 酶用量對(duì)固定化蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of proteinase amount on the activity of immobilized enzyme

載體上偶聯(lián)的酶量直接影響著固定化酶的活力，由圖5可知，開(kāi)始隨著酶用量值的升高，固定化酶的活力增加，但酶用量3mg時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大值，之后酶活力曲線隨著酶使用量的升高而呈平緩趨勢(shì)，這是因?yàn)槲於┙宦?lián)后的殼聚糖載體與酶結(jié)合的醛基數(shù)量是一定的。在本研究中，酶用量值為3mg時(shí)，固定化酶活力最大是25.6U。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以殼聚糖質(zhì)量濃度、酶用量、交聯(lián)時(shí)間、戊二醛質(zhì)量濃度為變量，展開(kāi)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶的條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)， 5組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)(表2)。利用Design-Expert 7.1.3軟件對(duì)固定化酶活力(Y)進(jìn)行多元回歸擬合，得到未編碼二次多項(xiàng)式擬合方程為：Y=30.16ˉ0.3583X1ˉ0.7167X2ˉ2.7417X3ˉ 0.2667X4+2.35X1X2ˉ0.675X1X3+1.65X2X3ˉ2.05X2X4+ 0.75X3X4ˉ4.855X12ˉ4.0425X22ˉ1.58X32ˉ6.4675X42。

表3 固定化酶活性的二次多項(xiàng)模型方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model for the activity of immobilized enzyme

表4 固定化酶活力的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of each regression coefficient in the fitted quadratic polynomial model for the activity of immobilized enzyme

圖6 不同變量對(duì)固定化酶活力的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of different variables on the activity of immobilized enzyme

從該模型的表3方差分析可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有較高的顯著性。其中R2Adj=0.9104，失擬項(xiàng)P=0.1534＜0.05，說(shuō)明二次多項(xiàng)式回歸模型正確，回歸效果較好。用該模型對(duì)固定化蛋白酶的條件進(jìn)行優(yōu)化是合適的。由表4可知，交聯(lián)時(shí)間(X3)的P值小于0.01，說(shuō)明其對(duì)固定化酶活力的影響最為顯著，影響固定化蛋白酶活性的因素為交聯(lián)時(shí)間(X3)＞酶用量(X2)＞殼聚糖質(zhì)量濃度(X1)＞戊二醛質(zhì)量濃度(X4)。X1、X2和X4的二次項(xiàng)P值小于0.01，可以看出這3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次拋物線的關(guān)系，從圖6可以看出響應(yīng)面曲面彎曲，說(shuō)明響應(yīng)面的變化較為復(fù)雜。方程中交互項(xiàng)X1X2、X2X3、X2X4回歸系數(shù)顯著性較高，說(shuō)明X1與X2，X2與X3，X2與X4交互影響顯著，正符合圖6中曲面彎曲較明顯。運(yùn)用Design Expert 7.13得出殼聚糖固定化瑞士乳桿菌蛋白酶活力的最佳條件為：殼聚糖質(zhì)量濃度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交聯(lián)時(shí)間1h、戊二醛質(zhì)量濃度0.40g/100mL，此時(shí)固定化酶活力為28.67U。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 7.1.3軟件獲得了各個(gè)因素的最佳水解條件組合為殼聚糖質(zhì)量濃度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交聯(lián)時(shí)間1h、戊二醛質(zhì)量濃度0.40g/100mL，此時(shí)固定化酶活力為28.67U。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，選取殼聚糖質(zhì)量濃度2.8g/100mL、酶用量3mg、交聯(lián)時(shí)間1h、戊二醛質(zhì)量濃度0.40g/100mL，做3組平行實(shí)驗(yàn)，固定化酶活力可達(dá)(28.40±0.67)U，所得結(jié)果與最佳條件下所得的結(jié)果誤差均在±1%以內(nèi)，由此可見(jiàn)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)瑞士乳桿菌蛋白酶的固定化條件的進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用殼聚糖固定化瑞士乳桿菌蛋白酶，通過(guò)單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了瑞士乳桿菌蛋白酶的固定條件：凝結(jié)液NaOH-甲醇(體積比3:1) 4g/100mL、殼聚糖質(zhì)量濃度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交聯(lián)時(shí)間1h、戊二醛質(zhì)量濃度0.40g/100mL。本實(shí)驗(yàn)確定了殼聚糖固定化瑞士乳桿菌蛋白酶的固定化條件，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用提供了參考。

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Optimization of Process Conditions for Immobilization of Lactobacillus helveticus Proteinase with Chitosan

WANG Cui-cui1，GUO Yu-xing1,*，PAN Dao-dong1,2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Immobilized Lactobacillus helveticus proteinase was prepared using chitosan as carrier and glutaraldehyde as crosslinking agent by adsorption and cross-linking method. The effects of condensate, chitosan concentration, enzyme amount, crosslinking time, and glutaraldehyde concentration on immobilization efficiency of Lactobacillus helveticus proteinase as indicated by the activity of immobilized proteinase were explored based on single factor experiments. The optimal immobilization conditions were determined by response surface analysis to be a mixture of NaOH and methanol at a ratio of 3:1 as condensate at a dose of 4 g/100 mL, 2.89 g/100 mL chitosan concentration, 2.95 mg enzyme amount, 1 h cross-linking time and 0.4 g/100 mL glutaraldehyde concentration.

Lactobacillus helveticus proteinase；immobilization；enzyme activity

TS252.54

A

1002-6630(2012)03-0110-06

2011-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101314)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2011787)；江蘇省教育廳高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10KJB550003)；南京師范大學(xué)特聘教授、高層次人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(184070H2B08)

王翠翠(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：yiyi-wcc@163.com

*通信作者：郭宇星(1981—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn