范紅渠 周衛(wèi)兵 郝魯峰 邵 磊 王智勇

nm23-H1在口腔癌中已明確為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，同時(shí)口腔癌轉(zhuǎn)移大多沿局部淋巴結(jié)發(fā)生，因此選擇對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用、又可抑制腫瘤發(fā)生的nm23-H1基因具有重要的臨床意義[1]，nm23-H1是進(jìn)行基因治療的理想基因，因而日益受到人們的重視[2，3]。我們選擇腺病毒(adenovirus，Ad)作為基因治療的載體，運(yùn)用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶全長(zhǎng)nm23-H1基因的重組腺病毒Ad-nm23-H1，為進(jìn)一步研究Ad-nm23-H1腫瘤轉(zhuǎn)移抑制活性奠定了基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 試劑和材料 AdEasyTMAdenoviralVector System中的質(zhì)粒pShuttle-CMV、pAdEasy-1及表達(dá)腺病毒E1區(qū)功能的人胚腎293細(xì)胞(Stratagene，美國(guó))；大腸桿菌菌株BJ5183、DH5α、脂質(zhì)體Lipofectamine2000及含人nm23-H1 cDNA的質(zhì)粒pcDNA3.1-nm23-H1(Invitrogen，美國(guó))；限制性?xún)?nèi)切酶 Sac II、Eco R I、Pac I及 Pme I(TaKaRa，日本)；T4DNA連接酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、DL15000(大連寶生物公司，中國(guó))；膠回收試劑盒、總RNA提取試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒(上海華舜公司，中國(guó))；病毒基因組DNA提取試劑盒(上海生工公司，中國(guó))；一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen，德國(guó))；PTC-200 型 PCR 儀(MJ，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 nm23-H1基因的PCR擴(kuò)增 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nm23-H1經(jīng)Sac II、Eco R I酶切后，膠回收nm23-H1基因片段。以該片段為模板，用引物Primer a和Primer b PCR擴(kuò)增帶有Sac II、Eco R I酶切位點(diǎn)的nm23-H1片段。引物序列：Primer a(上游引物)：5’-GCGTCGACATGGC TATGATGGAGGTC-3’，含有Sac II酶切位點(diǎn)和起始密碼子；Primer b(下游引物)：5’-GCGATATCTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’，含有Eco R I酶切位點(diǎn)和終止密碼子。

1.2.2 重組穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-nm23-H1的構(gòu)建 擴(kuò)增出的目的基因經(jīng)Sac II、Eco R I雙酶切后，T4 DNA連接酶分別連接經(jīng)同樣的酶雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV和nm23-H1片段，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttleCMV-nm23-H1。轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆。小提質(zhì)粒，用Sac II和Eco R I雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步通過(guò)DNA雙向測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建無(wú)誤。

1.2.3 重組腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-nm 23-H1的構(gòu)建與鑒定[4]把腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，電轉(zhuǎn)化條件設(shè)置為：200Ω，215kv，25μF。篩選陽(yáng)性BJ5183，制備成電轉(zhuǎn)化用的感受態(tài)細(xì)胞備用。PmeⅠ酶切pShuttle-CMV-nm23-H1重組質(zhì)粒使之線性化，電泳后膠回收酶切產(chǎn)物，加入堿性磷酸酶去磷酸化酶處理。取100-400ng線性化的pShuttle-CMV-nm23-H1電轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，利用大腸桿菌的同源重組機(jī)制獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒，然后室溫放置5-10min，直接涂布在含卡那霉素的LB平板上，次日挑取10-20個(gè)形態(tài)最小的克隆在5mL含50μg/mL卡那抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15h。堿裂解法小提質(zhì)粒，PCR及Pac I酶切鑒定，陽(yáng)性重組子命名為pAdEasy-nm23-H1。將鑒定正確的腺病毒重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以大量擴(kuò)增重組腺病毒基因組質(zhì)粒。

1.2.4 重組腺病毒的包裝及大量擴(kuò)增 用含10%胎牛血清和200U/ml青霉素、250U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天用無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)，豐度達(dá)70%時(shí)用Lipofectamine2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體將重組腺病毒載體pAdEasy-nm23-H1轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后14d用首次收集的病毒上清再次感染293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，以相同的凍融法收集病毒上清，用0.22μm濾膜過(guò)濾后分裝于2ml凍存管，-80℃保存。

1.2.5 病毒滴度測(cè)定 應(yīng)用TCID50法測(cè)病毒感染性滴度[5]：在96孔板中培養(yǎng)293細(xì)胞至長(zhǎng)成單層，分別加人不同稀釋度病毒液，每個(gè)稀釋度做8個(gè)復(fù)孔，設(shè)立3個(gè)空白對(duì)照，每天觀察至不再出現(xiàn)CPE為止，TCID50法計(jì)算病毒滴度。

1.2.6 病毒擴(kuò)增后重組腺病毒基因組PCR鑒定 裂解重組腺病毒傳代感染的293細(xì)胞，提取腺病毒基因組DNA作為模板，PCR分析經(jīng)傳代后外源基因插入腺病毒基因組中的情況，所用的引物為pShuttle-CMV通用引物：Forward：5’-GG TCTATATAAGCAGAGCTG-3’， Reverse：5’-GTGGTATGGCTGATTATGATCAG-3’。用未線性化的腺病毒基因組質(zhì)粒AdEasy-1轉(zhuǎn)染293，并模擬重組病毒傳代相同次數(shù)，提取DNA作為PCR陰性對(duì)照模板。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)nm23-H1基因在293細(xì)胞中的表達(dá) 取兩只T-25培養(yǎng)瓶的293細(xì)胞，待80%鋪滿(mǎn)時(shí)，分別接種重組腺病毒和空腺病毒，按試劑盒說(shuō)明分別抽取細(xì)胞總RNA。以Qiagen一步法RT-PCR反應(yīng)體系要求配制反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后取5μ L進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)條帶大小。

2.結(jié)果

2.1 nm23-H1基因克隆與重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nm23-H1經(jīng)Sac II、 Eco R I酶切后，利用帶有酶切位點(diǎn)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出一條大小約460bp的條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期相符(圖1)。重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-nm23-H1酶切后出現(xiàn)大小為7.5kb和460bp的兩個(gè)條帶，而單純的穿梭質(zhì)粒只有一條7.5kb的條帶(圖2)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)條帶大小460bp的核苷酸序列與Genebank上nm23-H1 cDNA(BC000293)序列完全一致，且插入方向正確。

2.2 重組腺病毒基因組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-nm23-H1經(jīng)Pme I線形化，然后轉(zhuǎn)染含pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183，通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-nm23-H1。以Pac I酶切鑒定候選重組子，瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)酶切可獲得穿梭質(zhì)粒所特有的長(zhǎng)度為3.0 kb的片段(圖3)。腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1都各有Pac I酶切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)Pac I酶切就能得到一大(30kb)和一小3.0kb(重組發(fā)生在骨架質(zhì)粒右臂和左臂)或4.5kb(重組發(fā)生在骨架質(zhì)粒右臂和復(fù)制起點(diǎn)區(qū))兩個(gè)片段(圖4)。以重組腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-nm23-H1為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約460bp的條帶，與目的片段大小一致，而空腺病毒基因組質(zhì)粒不能擴(kuò)出相應(yīng)條帶(圖5)。

2.3 重組腺病毒滴度測(cè)定TCID50法測(cè)病毒感染性滴度：重組腺病毒：T=109.5(3.4×109)TCID50/mL；空腺病毒：T=109.3(1.9×109)TCID50/mL

2.4 擴(kuò)增后重組腺病毒基因組PCR鑒定 裂解重組腺病毒傳代感染的293細(xì)胞，提取腺病毒基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出與目的基因大小nm23-H1相當(dāng)?shù)?60bp條帶(圖6)。

2.5 RT-PCR法檢測(cè)nm23-H1在293細(xì)胞中的表達(dá) 抽提感染重組腺病毒的293細(xì)胞總RNA，RT-PCR可以擴(kuò)增出大小約460bp的片段，與目的片段大小一致(圖7)，而感染空腺病毒的細(xì)胞不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

3.討論

nm23基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，多數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)[6-8]。nm23基因是一個(gè)具有高度同源性的保守基因家族，迄今nm23基因家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9個(gè)成員，分別為nm23-H1至nm23-H9，其中與腫瘤關(guān)系最為密切也是臨床上研究最多的是nm23-H1[6]。如何實(shí)現(xiàn)目的基因nm23-H1的穩(wěn)定、高效和安全的表達(dá)是當(dāng)前研究癌轉(zhuǎn)移以及將nm23-H1用于基因治療前提和基礎(chǔ)。

基因轉(zhuǎn)移(Gene transfer)指借助于載體(Vertor)將目的基因轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的過(guò)程[7]。載體則是基因轉(zhuǎn)移的工具。某種意義上，載體是構(gòu)建的含有治療基因插入位點(diǎn)的DNA或者RNA序列。腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約30-50kb，由非結(jié)構(gòu)性早期基因(El-E4)、編碼結(jié)構(gòu)蛋白的晚期基因和RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄子組成。本研究所選擇的AdEasy-1載體系統(tǒng)屬于E1、E3區(qū)雙缺失型Ad5型腺病毒載體系統(tǒng)，是較為成熟、高效的腺病毒載體系統(tǒng)，具有在體外穩(wěn)定、易于制備、純化、濃度高、容量大、能夠轉(zhuǎn)染終末分化細(xì)胞并不整合入宿主等優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)菌內(nèi)同源重組被認(rèn)為是重組腺病毒構(gòu)建過(guò)程中的難點(diǎn)，因?yàn)槲淳€性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉(zhuǎn)移載體必須用PmeI線性化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使按操作手冊(cè)的方法，重組效率仍然不高，因此有必要將原細(xì)菌內(nèi)同源重組方法作進(jìn)一步改進(jìn)。研究表明，把原方案中的一步共轉(zhuǎn)化分成兩步完成，即先把一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BJ5183,然后轉(zhuǎn)化第二個(gè)質(zhì)粒，可以大大提高重組效率。用改進(jìn)后的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在一次操作中能夠獲得幾十個(gè)重組子，而且出現(xiàn)了預(yù)期的兩種同源重組類(lèi)型，即通過(guò)腺病毒序列同源重組和質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)同源重組。

從重組所借助的同源序列來(lái)看，AdEasy系統(tǒng)允許發(fā)生兩種同源重組，一種是通過(guò)轉(zhuǎn)移載體和腺病毒基因組質(zhì)粒之間的腺病毒同源序列(左臂和右臂)進(jìn)行重組；另一種則是通過(guò)兩個(gè)質(zhì)粒相同的復(fù)制起點(diǎn)(Ori)和腺病毒序列右臂之間的同源重組。同時(shí)存在兩組同源序列有利于提高重組效率，兩種重組子具有等同的使用價(jià)值。經(jīng)過(guò)改進(jìn)，大大提高了重組效率，但同時(shí)也增加了非重組子的比例，增加了后續(xù)篩選陽(yáng)性重組子的工作量。所以在操作中，我們注意了一些小的技巧。例如，電轉(zhuǎn)化后室溫放置5-10min，然后直接涂布含卡那霉素的平板，而無(wú)需37℃孵育半小時(shí)，這樣可以降低非重組子的比例。在挑選克隆進(jìn)行鑒定時(shí)，我們挑選克隆形態(tài)最小的，因?yàn)橥螒B(tài)最小的克隆陽(yáng)性重組率較高。

線性化的重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞是產(chǎn)生重組腺病毒的又一關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)染之前，Pac I消化重組腺病毒基因組質(zhì)粒的目的一是切除卡那抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)Ori等原核質(zhì)粒序列，二是釋放重組腺病毒基因組。用于產(chǎn)生重組腺病毒的293細(xì)胞是5型腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞，染色體整合有人腺病毒5型E1區(qū)序列，可反式支持E1缺陷的重組腺病毒的增殖。在轉(zhuǎn)染后7-10天內(nèi)，病毒基因表達(dá)并產(chǎn)生出早期的重組腺病毒顆粒，但滴度太低不足以形成典型的細(xì)胞病變。將這些細(xì)胞收獲裂解，用裂解液再進(jìn)行新的感染，3-4天可觀察到明顯的細(xì)胞病變。用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒的周期在20d左右，較以往的方法大大節(jié)省了時(shí)間，而且AdEasy系統(tǒng)產(chǎn)生的重組病毒純度很高。這是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)染之前，重組病毒的基因組以純化的質(zhì)粒形式存在，因此參與病毒包裝的基因組非常均一；而經(jīng)典方法是通過(guò)293細(xì)胞內(nèi)同源重組直接產(chǎn)生病毒顆粒，所有符合包裝條件的同源重組產(chǎn)物都參與病毒的組裝，重組病毒純度必然受到影響。因此，對(duì)于經(jīng)典方法來(lái)說(shuō)，用多次挑取噬斑擴(kuò)增的方法來(lái)純化重組病毒是必不可少的步驟，工作量巨大而且周期長(zhǎng)。AdEasy系統(tǒng)產(chǎn)生的重組病毒純度通常高于95%，可滿(mǎn)足絕大部分實(shí)驗(yàn)的要求，節(jié)省了大量時(shí)間和實(shí)驗(yàn)材料。

我們對(duì)重組腺病毒進(jìn)行了多種指標(biāo)的檢測(cè)。外源nm23-H1基因整合到腺病毒基因組中，用PCR直接擴(kuò)增基因組DNA可以擴(kuò)增出nm23-H1 cDNA，而空腺病毒基因組質(zhì)粒不能擴(kuò)出相應(yīng)條帶，從而證明了目的基因nm23-H1已經(jīng)整合到腺病毒基因組質(zhì)粒中。RT-PCR鑒定也證實(shí)重組腺病毒構(gòu)建取得了預(yù)期結(jié)果，重組腺病毒攜帶的nm23-H1基因的表達(dá)也比較理想。

綜上所述，AdEasy系統(tǒng)是目前最先進(jìn)的腺病毒載體系統(tǒng)之一，具有構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)便快速，重組病毒均一等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)重組方法略加改進(jìn)，使細(xì)菌內(nèi)同源重組效率及重組病毒純度均顯著提高。本部分為進(jìn)一步研究以腺病毒作載體的nm23-H1基因?qū)ι喟┘?xì)胞生物學(xué)行為研究奠定了基礎(chǔ)。

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