王 存 薛蕓霞 楊亞兵 傅 婷 李志杰 夏潮涌

哺乳動物的胎兒經(jīng)分娩脫離母體成為獨立個體，其出生前后的生存環(huán)境發(fā)生了巨大的改變，如脫離了胎盤和臍帶的血液循環(huán)、從沒有外呼吸到自主外呼吸、生活空間從比較黑暗變?yōu)槊髁恋?，這一系列的改變導(dǎo)致機體發(fā)生顯著的生理變化［1］。成年哺乳動物的角膜神經(jīng)纖維分布已得到廣泛的研究［2-6］，但是，對出生前后小鼠角膜神經(jīng)變化的研究報道極少，盡管McKenna等［7］觀察了C57/BL6小鼠胚胎期和出生后的角膜神經(jīng)分布，卻未對其進行動態(tài)的定量分析。為此，本實驗使用免疫熒光染色法顯示和記錄出生前后小鼠完整角膜的所有神經(jīng)纖維，并對其進行定量分析，以期了解小鼠出生前后角膜神經(jīng)纖維的長度和密度是否有變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只C57/BL6小鼠購于中山大學動物實驗中心，雌雄隨機，均無眼病。按出生前后不同時期將小鼠分為4組:胚胎期17 d(E17 d)組、胚胎期20 d(E20 d)組、出生當天(P0 d)組、出生后3 d(P3 d)組，每組5只小鼠(10只角膜)。實驗動物的使用嚴格遵循國家科學技術(shù)委員會發(fā)布的《實驗動物管理條例》。

1.2 取材 斷頸法急性處死小鼠后，在奧林巴斯體視顯微鏡(SZ61，日本)下，將刀片從眼球角膜緣處切入，并穿過對面，先切開一側(cè)，再用維納斯剪剪開另一側(cè)，成功取下角膜，置于0.1 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，用鑷子剝離虹膜和鞏膜等角膜周邊組織，期間鑷子應(yīng)盡量避免觸碰角膜，尤其是角膜上皮，以免損傷角膜神經(jīng)，影響實驗結(jié)果。

1.3 免疫熒光染色 按以下步驟對角膜組織進行免疫熒光染色［8］:20 g·L-1多聚甲醛4℃固定1 h，0.1 mmol·L-1PBS 清洗3 次，每次5 min，20 g·L-1牛血清白蛋白和0.1 mmol·L-1PBS混合物(BSAPBS)(捷倍斯，中國)室溫封閉15 min，體積分數(shù)0.1%Triton X-100(國奧，中國)室溫透膜15 min，抗神經(jīng)元β-微管蛋白Ⅲ抗體(NL557，美國)4℃避光孵育過夜，0.1 mmol·L-1PBS清洗3次，每次5 min。

1.4 角膜分區(qū)與角膜整組織鋪片 在倒置顯微鏡下，角膜上皮朝上，用刀片將角膜呈放射狀切成4部分:背鼻側(cè)(dorsal nasal side，DN)、背顳側(cè)(dorsal temporal side，DT)、腹鼻側(cè)(ventral nasal side，VN)、腹顳側(cè)(ventral temporal side，VT)，用鑷子將角膜組織充分展開(無褶皺)，使角膜能夠充分與玻片接觸，便于拍照。鋪片后加抗熒光淬滅封片液(碧云天，江蘇)封片，避光保存。

1.5 拍照和定量分析 使用熒光顯微鏡(Leica，德國)拍照，觀察完整角膜的神經(jīng)纖維分布，測量其表面積(Image-Pro Plus 5.1軟件)。使用DeltaVision Core儀(Applied Precision，美國)對角膜進行掃描成像，每年齡組獲約200張圖片，計算整個角膜表面積范圍內(nèi)的神經(jīng)纖維密度和總長度。根據(jù)體視學測算線性結(jié)構(gòu)的原理［9］，為降低神經(jīng)纖維走向的方向性所造成的誤差，采用8條水平曲線(長6.94 mm，間距0.53 mm)測試框，計數(shù)神經(jīng)纖維與測試框內(nèi)水平曲線的交叉點數(shù)，計算交叉點數(shù)與該框內(nèi)曲線總長度的比值PL(即交叉點密度)，然后計算每單位角膜表面積的神經(jīng)纖維長度即角膜神經(jīng)纖維密度(LA):LA=π/2×PL。完整角膜表面積乘以角膜神經(jīng)纖維密度即為整個角膜神經(jīng)纖維總長度。所有計量結(jié)果以±s表示，采用SPSS 17.0軟件的獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠角膜的神經(jīng)纖維分布 E20 d組的角膜神經(jīng)纖維分布明顯比E17 d組和P0 d組更密集，與P3 d組的疏密程度相似，各年齡組內(nèi)角膜4個分區(qū)間的神經(jīng)分布無明顯差異。角膜基質(zhì)神經(jīng)纖維的直徑明顯大于上皮神經(jīng)纖維，角膜外周的神經(jīng)纖維直徑明顯大于角膜中央，隨著年齡的增長，角膜基質(zhì)神經(jīng)纖維越來越少(圖1)。

2.2 小鼠角膜表面積的變化 E17 d組、E20 d組、P0 d組和P3 d組的角膜表面積分別為(0.34±0.03)mm2、(0.39 ± 0.03)mm2、(0.46 ± 0.06)mm2和(0.51±0.01)mm2，角膜表面積隨年齡的增長而逐漸增大，相鄰年齡組間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05)，但E17 d組和P3 d組、E20 d組和 P3 d組間角膜表面積差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)。

2.3 小鼠角膜神經(jīng)纖維密度與總長度隨年齡的變化 角膜神經(jīng)纖維總長度與神經(jīng)纖維密度的變化趨勢相似，具體見圖2。E17 d組和E20 d組的角膜神經(jīng)纖維密度分別為(9.11±0.65)mm·mm-2和(13.04±1.83)mm·mm-2，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而P0 d組的角膜神經(jīng)纖維密度為(9.02±0.45)mm·mm-2，較 E20 d組減少了30.82%(P＜0.05)。P3 d組的角膜神經(jīng)纖維密度為(12.87±1.04)mm·mm-2，比 P0 d組增加了42.70%(P＜0.01)，與 E20 d組相似(P＞0.05)。E17 d組、E20 d組、P0 d組和P3 d組的角膜神經(jīng)纖維總長度分別為(3.10±0.59)mm、(5.09±1.03)mm、(4.15±0.46)mm 和(6.56±1.11)mm。從E17 d組到E20 d組、E20 d組到P0 d組、P0 d組到P3 d組，神經(jīng)纖維總長度分別增加了64.23%、減少了18.41%、增加了58.20%(均為P＜0.05)。不同年齡組角膜4個分區(qū)神經(jīng)纖維密度見表1。由表1知，角膜各分區(qū)神經(jīng)纖維密度的變化趨勢與整個角膜神經(jīng)纖維密度的變化趨勢一致。

Figure 1 Corneal innervation in different age groups(×5).A:E17 d group;B:E20 d group;C:P0 d group;D:P3 d group 不同年齡組小鼠角膜神經(jīng)纖維分布情況(×5)。A:E17 d組;B:E20 d組;C:P0 d組;D:P3 d組

Figure 2 Changes of corneal nerve fiber density(A)and total length(B)with age increase(Compared with the former age group，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01) 角膜神經(jīng)纖維密度(A)和總長度(B)隨鼠齡的變化曲線(與前一個年齡組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01)

表1 不同年齡組角膜4個分區(qū)神經(jīng)纖維密度情況Table1 Corneal nerve fiber density in four regions in different age groups (Density/mm·mm-2)

3 討論

哺乳動物的角膜是透明的，無血管分布，具有密集的神經(jīng)分布，主要包括感覺和自主神經(jīng)纖維［5］。這些角膜神經(jīng)纖維對于刺激和疼痛都非常敏感，可保護角膜以及眼部其他部分免受外界環(huán)境的傷害。而且角膜神經(jīng)主要通過釋放能夠保持上皮穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)和激活能夠刺激產(chǎn)生淚液和眨眼的腦干回路發(fā)揮感覺功能，這對于保持眼表功能的完整性具有重要作用［2］。角膜神經(jīng)纖維的缺失會導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎，其臨床表現(xiàn)為角膜感覺缺失、干燥［2］。因此，研究發(fā)育各階段角膜的神經(jīng)分布對角膜神經(jīng)纖維相關(guān)疾病的診斷與治療具有重要意義。但是用于角膜神經(jīng)發(fā)育研究的人眼標本是難以得到的。雖然C57/BL6小鼠的體型明顯小于人類，但是它們的眼部結(jié)構(gòu)與人類非常相似，并且二者的基因組有許多相同的區(qū)域。因此，本實驗選擇C57/BL6小鼠作為實驗動物。

以往的研究通常使用共聚焦顯微鏡記錄角膜的神經(jīng)纖維并對其進行定性或定量分析，但是共聚焦顯微鏡無法記錄直徑小于0.5 μm的神經(jīng)纖維［10-13］。因此，本實驗使用DeltaVision Core儀顯示并記錄了角膜上的所有神經(jīng)纖維，彌補了共聚焦顯微鏡的這一不足。McKenna等［7］曾報道，角膜的DT分區(qū)是最晚發(fā)現(xiàn)神經(jīng)束的。我們前期的研究［14］也證實了在小鼠睜眼前后，角膜神經(jīng)纖維的發(fā)育會受到一定程度的影響，與文獻報道不同的是，我們發(fā)現(xiàn)DN區(qū)神經(jīng)纖維密度的變化趨勢異于其他3個分區(qū)(DT、VN和VT區(qū))。因此，本實驗分別對角膜4個分區(qū)的神經(jīng)纖維進行了定量分析。結(jié)果顯示，角膜4個分區(qū)不同年齡組間神經(jīng)纖維密度的變化趨勢一致。

本文結(jié)果顯示，角膜表面積隨年齡的增長而逐漸增大，分娩過程和出生前后生存環(huán)境的變化并沒有對其產(chǎn)生明顯的影響，但會使角膜神經(jīng)纖維密度和總長度明顯減少。當新生鼠適應(yīng)出生后的生存環(huán)境后，角膜神經(jīng)纖維總長度和密度會補償性增長。分析其原因可能為:(1)分娩過程中產(chǎn)道會對機體擠壓從而造成傷害，也可能會擠壓或摩擦角膜，角膜上皮具有密集的神經(jīng)分布，且這些神經(jīng)纖維易受到損傷，但是這種損傷是可以自動修復(fù)的［8］。(2)小鼠生存空間與狀態(tài)的改變，如出生前主要通過臍帶獲得母體的營養(yǎng)和排泄代謝產(chǎn)物，沒有自主的外呼吸，而新生鼠由母乳攝取營養(yǎng)并有自主的外呼吸。這種改變可能會引起小鼠生理機能等多方面的暫時性改變，包括角膜神經(jīng)纖維的暫時性減少。(3)光線是視覺系統(tǒng)的動力，而且光線的刺激是視桿細胞光敏感性發(fā)育的關(guān)鍵因素之一［15］。光線中的紫外線B(ultra violetray B，UVB)會導(dǎo)致眼部視覺的傷害性改變［16］，而眼表的高紫外線吸收率在一定程度上可保護眼球內(nèi)部免受UVB的傷害［17］。最近有研究報道，高劑量的UVB直接照射角膜會改變其形態(tài)并引起新陳代謝紊亂，甚至導(dǎo)致眼部視覺的傷害性改變［16］，但是，UVB可通過間接機制調(diào)控角膜上皮細胞抗氧化劑和促炎癥反應(yīng)因子的表達來調(diào)整炎癥反應(yīng)和保護角膜免受UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的刺激［18］。運用紫外線A/核黃素療法治療圓錐角膜時，損傷的角膜神經(jīng)纖維隨后可以再生［19］，還有報道，光線會改變?nèi)嫔窠?jīng)的活力［20］。顯然，光線尤其是紫外線會對角膜及其上的神經(jīng)纖維產(chǎn)生一定的影響。盡管新生小鼠并未睜眼，但是小鼠的眼瞼很薄，出生后的光線強度明顯大于出生前，也可能會對角膜上皮神經(jīng)纖維造成損傷。本文結(jié)果提示，如果人出生前后角膜神經(jīng)纖維的發(fā)育也存在與小鼠類似的情況(即新生兒的角膜神經(jīng)纖維密度與總長度低于出生前，隨后追趕性增長)，那么這無疑會為人角膜神經(jīng)纖維的研究提供一個思路。

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