吳 愷 劉二華 譚 鋼 邵 毅

上皮鱗狀化生是非角化的復(fù)層扁平上皮向角質(zhì)化復(fù)層上皮轉(zhuǎn)化的一種特殊的病理過程［1-3］。角膜和結(jié)膜上皮鱗狀化生非常多見，如干眼、干燥綜合征、眼類天皰瘡、眼化學(xué)性燒傷、翼狀胬肉、瞼裂斑和維生素A缺乏癥等［4］，它常常導(dǎo)致視功能的嚴(yán)重喪失，是眼部致盲的主要原因之一。目前國(guó)內(nèi)外已有人研究發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉本身就是一種上皮鱗狀化生的重要模型。雷公藤多甙是一種雷公藤提取物，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。至今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見雷公藤多甙對(duì)上皮鱗狀化生作用的相關(guān)研究報(bào)道，本研究通過體外培養(yǎng)基浸沒培養(yǎng)人翼狀胬肉組織構(gòu)建上皮鱗狀化生，探討雷公藤多甙對(duì)上皮鱗狀化生的抑制作用及進(jìn)一步闡述其可能相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與處理 選擇2010年1月至6月在本院就診的原發(fā)性翼狀胬肉住院患者16例(16眼)。翼狀胬肉診斷標(biāo)準(zhǔn):患者無外傷史，未做過翼狀胬肉手術(shù)或常規(guī)藥物治療，翼狀胬肉病變組織侵入角膜超過角鞏膜緣3 mm以上或瘢痕組織嚴(yán)重增生影響美容及限制眼球運(yùn)動(dòng)。眼科檢查排除慢性淚囊炎、沙眼、瞼緣炎、過敏性結(jié)膜炎及其他眼表疾病的病例，所有病例無長(zhǎng)期眼科用藥史。所有翼狀胬肉患者均由同一人行翼狀胬肉切除術(shù)。具體方法如下:常規(guī)消毒，5 g·L-1的卡因表面麻醉，于翼狀胬肉頸部即角結(jié)膜交界處注射適量的20 g·L-1利多卡因，顯微鏡下用剪刀分離翼狀胬肉與周圍正常角結(jié)膜后剪除翼狀胬肉頭部，清除變性的角膜和結(jié)膜下組織后，上下方結(jié)膜傷口邊緣直接縫合8-0可吸收縫線1～2針。術(shù)畢結(jié)膜囊涂妥布霉系眼膏，術(shù)眼包扎。術(shù)后3 d每晨換藥，予妥布霉素滴眼液滴術(shù)眼每日4次，妥布霉素眼膏涂眼每晚1次。術(shù)后7～10 d停藥。術(shù)后的隨訪時(shí)間為1個(gè)月。記錄所有患者的原始數(shù)據(jù)和隨訪數(shù)據(jù)。將術(shù)中剪除下來的翼狀胬肉頭部放于含體積分?jǐn)?shù)5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于30 min內(nèi)送于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 人翼狀胬肉組織的體外培養(yǎng) 從翼狀胬肉患者眼部取下胬肉頭部組織，用含有50 g·L-1慶大霉素和1.25 g·L-1兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基漂洗3次，每次2 min;解剖顯微鏡下用顯微器械除去翼狀胬肉下筋膜組織，并將含有完整上皮和基質(zhì)的翼狀胬肉組織頭部剪成約2 mm×2 mm的組織小片;將上皮面朝上的翼狀胬肉組織小片平鋪于已準(zhǔn)備好的嵌入物或培養(yǎng)皿的濾膜上中央部位。將上述鋪有翼狀胬肉組織的培養(yǎng)皿嵌入物置于24孔板培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入SHEM培養(yǎng)基或濃度為100 μg·L-1雷公藤多甙SHEM培養(yǎng)基，并使翼狀胬肉上皮浸沒于培養(yǎng)液中;將上述翼狀胬肉組織置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱(37℃，95%濕度)中培養(yǎng)，每2 d換液1次，翼狀胬肉組織分別連續(xù)培養(yǎng)7 d和14 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將翼狀胬肉組織進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組使用SHEM培養(yǎng)基Submerge培養(yǎng)法培養(yǎng)翼狀胬肉組織，實(shí)驗(yàn)組在含100 μg·L-1雷公藤多甙的SHEM培養(yǎng)基中用Submerge培養(yǎng)法培養(yǎng)翼狀胬肉組織。兩組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各培養(yǎng)3個(gè)翼狀胬肉組織小片。DAPI染色確定培養(yǎng)組織的上皮層數(shù)。

1.4 免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)K14 將冰凍切片復(fù)溫、晾干，置于-20℃丙酮中固定，體積分?jǐn)?shù)1%PBS漂洗3遍，加20 g·L-1牛血清蛋白去除非特異性染色。滴加用10 g·L-1牛血清蛋白稀釋的一抗(1∶200，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司)，體積分?jǐn)?shù)1%PBS漂洗3遍后，在避光條件下滴加以綠色熒光素標(biāo)記的二抗。用DAPI(H-1200)封片，熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Pax6和Ki67 根據(jù)SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。將冰凍切片復(fù)溫、晾干，置于-20℃丙酮中固定，體積分?jǐn)?shù)1%PBS漂洗3遍，體積分?jǐn)?shù)0.6%過氧化氫滅活細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后，滴加一抗(1∶200，均購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司)及二抗，DAB顯色，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，照相記錄結(jié)果。

1.6 Western blot檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集后，稱質(zhì)量，碾碎后提取各組實(shí)驗(yàn)樣本的總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，然后 Western blot印記雜交，轉(zhuǎn)膜，Block Buffer溶液封閉，Block Buffer溶液以適當(dāng)比例稀釋一抗(Pax6、K14)，在塑封袋中孵育抗體，4℃過液。用TBST洗滌一抗，在側(cè)擺搖床上快速搖動(dòng)，洗滌3次，每次10 min。用Block Buffer溶液以適當(dāng)比例稀釋二抗，在側(cè)擺搖床上，緩慢搖動(dòng)，室溫孵育60 min。用TBST洗滌二抗，在側(cè)擺搖床上快速搖動(dòng)，洗滌3次，每次10 min。利用增強(qiáng)的化學(xué)放射發(fā)光法，標(biāo)記結(jié)合信號(hào)后進(jìn)行顯影。

1.7 圖像分析 采用Nikon TE2000倒置熒光顯微鏡、FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡、Nikon光學(xué)顯微鏡和Nikon NIS專業(yè)圖像分析軟件采集系統(tǒng)對(duì)各組翼狀胬肉組織切片Pax6、Ki67和K14免疫熒光和免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行拍照，運(yùn)用圖像分析軟件Image Pro Plus V6.0對(duì)翼狀胬肉組織切片的免疫熒光和免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，將彩色的熒光和組織化學(xué)圖片還原成灰度圖片后作黑白反相，作光密度矯正后在count/size中選擇相應(yīng)強(qiáng)度的閾值，測(cè)量陽性結(jié)果的光密度值(integrated optical density，IOD)，取其平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用隨機(jī)對(duì)照方法，各組各時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，使用Windows XP操作系統(tǒng)下的統(tǒng)計(jì)分析軟件Prism 4.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)IOD以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組培養(yǎng)7 d后，翼狀胬肉上皮層數(shù)增加，為(11.50±3.50)層，上皮變得不完整，形態(tài)由直線變成鋸齒生長(zhǎng);實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)7 d后，翼狀胬肉上皮層數(shù)未見明顯增加，為(7.50±3.50)層，形態(tài)依然為直線狀生長(zhǎng)，兩組上皮層數(shù)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.778，P＜0.05)。14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組上皮層數(shù)為(7.50±3.00)層，對(duì)照組為(13.00±4.00)層，兩組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.393，P＜0.05)。

2.2 Pax6的表達(dá)情況 對(duì)照組培養(yǎng)7 d后，Pax6幾乎無表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組上皮層中可見有Pax6的表達(dá)。與培養(yǎng)前正常翼狀胬肉組織(光密度值為6896.28±571.95)相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)14 d后，Pax6在上皮細(xì)胞核中的表達(dá)未見明顯變化(光密度值為6923.76±225.26)，而對(duì)照組Pax6的表達(dá)顯著降低(光密度值為178.84±126.18)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.328，P＜0.05;圖1-圖2)。

2.3 Ki67的表達(dá)情況 與培養(yǎng)前正常翼狀胬肉組織(光密度值為1034.78±599.17)相比，對(duì)照組Ki67在翼狀胬肉上皮的表達(dá)稍有增強(qiáng)(光密度值為1752.26±536.29)，實(shí)驗(yàn)組Ki67在翼狀胬肉上皮的表達(dá)明顯減少(光密度值為261.23±113.27)，兩組Ki67表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.486，P＜0.05;圖3)。

Figure 1 Pax6 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼狀胬肉組織培養(yǎng)14 d后Pax6的表達(dá)情況。A:正常翼狀胬肉組織;B:對(duì)照組;C:實(shí)驗(yàn)組

Figure 2 Western blot results showed the pterygium tissue after cultured 7 days and 14 days，Pax6 was expressed in epithelial layer in experiment group，but almost not in control group Western blot結(jié)果顯示翼狀胬肉組織體外培養(yǎng)7 d和14 d，實(shí)驗(yàn)組上皮層中可見有Pax6的表達(dá)，而對(duì)照組幾乎無Pax6表達(dá)

2.4 K14的表達(dá)情況 對(duì)照組培養(yǎng)7 d后可見有K14的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組上皮層中無K14表達(dá)。培養(yǎng)14 d后，實(shí)驗(yàn)組K14在上皮細(xì)胞核中無表達(dá)(光密度值為0)，而對(duì)照組K14表達(dá)未見明顯下降(光密度值為5489.7±996.22)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.464，P＜0.05;圖4-圖5)。

Figure 3 Ki67 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼狀胬肉組織培養(yǎng)14 d后Ki67的表達(dá)情況。A:正常翼狀胬肉組織;B:對(duì)照組;C:實(shí)驗(yàn)組

Figure 4 K14 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼狀胬肉組織培養(yǎng)14 d后K14的表達(dá)情況。A:正常翼狀胬肉組織;B:對(duì)照組;C:實(shí)驗(yàn)組

Figure 5 Western blot results showed the pterygium tissue after cultured 7 days and 14 days，K14 was expressed in epithelial layer in control group，but almost not in experiment group Western blot結(jié)果顯示翼狀胬肉組織體外培養(yǎng)7 d后和14 d后，實(shí)驗(yàn)組上皮層中K14幾乎無表達(dá)，而對(duì)照組可見有K14表達(dá)

3 討論

翼狀胬肉是眼科常見增生性致盲眼?。?］，常出現(xiàn)眼紅、異物感、干澀感等眼表不適癥狀，其發(fā)生、發(fā)展和日光中紫外線有密切的關(guān)系［6］。Pax6是控制從低等線蟲至人類多細(xì)胞動(dòng)物眼球發(fā)育的關(guān)鍵基因。出生以后眼部的Pax6表達(dá)逐漸局限于角結(jié)膜、晶狀體的上皮細(xì)胞、虹膜及視網(wǎng)膜的無長(zhǎng)突細(xì)胞［7］。研究表明，Pax6是翼狀胬肉發(fā)育過程中維持其上皮正常分化和生長(zhǎng)所必需的，結(jié)膜上皮細(xì)胞表達(dá)Pax6蛋白，而角化的皮膚上皮細(xì)胞不表達(dá)Pax6［8］。Ki67作為增殖的指標(biāo)，在正常的翼狀胬肉組織上皮基底層細(xì)胞核中散在陽性表達(dá);而角蛋白K14作為一個(gè)重要的上皮基底細(xì)胞的標(biāo)志物和組成蛋白［9］，局限在正常結(jié)膜的上皮基底層，并在翼狀胬肉和瞼裂斑中表達(dá)上調(diào)。本組實(shí)驗(yàn)中Pax6、Ki67和K14的表達(dá)變化恰好可以說明翼狀胬肉上皮鱗狀化生情況。

在本研究中，我們通過體外培養(yǎng)基浸沒法發(fā)現(xiàn)Pax6表達(dá)下調(diào)及Ki67、K14陽性表達(dá)的上調(diào)，證明了翼狀胬肉上皮的鱗狀化生(異常增殖及分化)模型體外構(gòu)建成功。連續(xù)培養(yǎng)14 d后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組翼狀胬肉組織上皮向外生長(zhǎng)速度及細(xì)胞層數(shù)有明顯差異。在實(shí)驗(yàn)組中，翼狀胬肉上皮細(xì)胞層數(shù)無明顯增加，同時(shí)上皮生長(zhǎng)形態(tài)與培養(yǎng)前正常翼狀胬肉組織相似;免疫組織化學(xué)染色顯示Pax6表達(dá)與培養(yǎng)前正常翼狀胬肉基本一致。這些均充分證明了雷公藤多甙可在一定程度上預(yù)防培養(yǎng)基浸沒培養(yǎng)的翼狀胬肉上皮鱗狀化生。我們還對(duì)兩組人翼狀胬肉組織上皮細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白Ki67和K14進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組翼狀胬肉組織上皮Ki67和K14的表達(dá)量均明顯低于其在對(duì)照組上皮的表達(dá)量，表明了雷公藤多甙可明顯下調(diào)Ki67和K14在翼狀胬肉上皮的陽性表達(dá)，在一定程度上預(yù)防培養(yǎng)基浸沒導(dǎo)致的翼狀胬肉上皮異常增殖。

雷公藤多甙有祛風(fēng)活絡(luò)、破瘀鎮(zhèn)痛等功效，是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、末梢神經(jīng)炎、骨髓炎、麻風(fēng)、紅斑狼瘡等的有效或特效藥物。雷公藤有顯著的抗炎和免疫抑制作用，其根部分離出的三種二萜環(huán)氧化合物，有明顯的抗白血病作用，是國(guó)內(nèi)首選的免疫抑制劑［10］，可用于治療葡萄膜視網(wǎng)膜炎及角膜移植排斥反應(yīng)［11-12］。雷公藤多甙有抗菌、抗病毒［13］和免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還能改善微循環(huán)和抑制成纖維細(xì)胞過度生長(zhǎng)［14］。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙可用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性腎病綜合征及降低腎性蛋白尿的作用，有效率高達(dá)85%［15］。此外，雷公藤多甙輔助治療紫癜型腎炎和難治性狼瘡性腎炎可以提高患者的緩解率、降低其復(fù)發(fā)率，而且對(duì)預(yù)后有積極作用。雷公藤多甙還能與強(qiáng)的松交替使用治療甲狀腺相關(guān)眼病。另有學(xué)者認(rèn)為雷公藤多甙可在短期內(nèi)降低胰島細(xì)胞抗體水平，對(duì)成人隱匿型自身免疫性糖尿病早期患者細(xì)胞免疫有調(diào)節(jié)作用，有改善胰島β細(xì)胞功能的趨勢(shì)。但對(duì)于雷公藤多甙在鱗狀化生方面的研究尚未見報(bào)道。

雷公藤多甙可以抑制翼狀胬肉上皮的鱗狀化生，這是雷公藤多甙的一種全新的生物活性，它可用于眼表上皮和其他黏膜上皮鱗狀化生性疾病的預(yù)防和治療，這將為雷公藤多甙臨床應(yīng)用提供更加廣闊的前景。同時(shí)，體外培養(yǎng)基浸沒可成功并較穩(wěn)定地培養(yǎng)人翼狀胬肉上皮的鱗狀化生體外模型，將為鱗狀化生的病理生理過程及發(fā)病機(jī)制的研究以及臨床鱗狀化生性疾病的防治提供一個(gè)良好的研究模型，但翼狀胬肉上皮鱗狀化生的具體發(fā)生和發(fā)展機(jī)制及雷公藤多甙抑制翼狀胬肉上皮鱗狀化生的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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