邱婷玉 鄭 毅 陳 燕

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響應(yīng)面法優(yōu)化蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)耐熱蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

邱婷玉 鄭 毅 陳 燕

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

采用二水平Plackett-Burman實驗設(shè)計對影響發(fā)酵培養(yǎng)基的8個成分進行顯著性分析，確定最重要的3因素為葡萄糖、酵母膏和ZnSO4；應(yīng)用響應(yīng)面分析法對這3個因素進行3水平優(yōu)化，獲得它們的最優(yōu)組合，得到優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：黃豆餅粉12、酵母膏4.24、葡萄糖5.43、KH2PO42、ZnSO40.39、MnSO40.42。優(yōu)化后產(chǎn)酶水平達到6473U/mL, 與響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值僅有0.49%的誤差。

蘇云金芽孢桿菌 Plackett-Burman設(shè)計 響應(yīng)面分析法 蛋白酶

0 引言

蛋白酶是一種重要酶制劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物制藥工業(yè)、化學(xué)洗滌劑工業(yè)、皮革工業(yè)，具有很高的應(yīng)用前景和商業(yè)價值。耐熱蛋白酶又因其具有較強的熱穩(wěn)定性而逐漸被人們重視[1]。本文對篩選到的1株產(chǎn)耐熱蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌FS42的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，采用Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，簡稱RSM）對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以快速提高該菌株產(chǎn)酶能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

蘇云金芽孢桿菌(，簡稱Bt)菌株FS42，為本實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、瓊脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（2）種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、瓊脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（3）始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：黃豆餅粉1.5g、葡萄糖0.5g、酵母膏0.7g、KH2PO40.25g、MgSO4·7H2O 0.035g、CaCO30.05g, pH為7.0。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)方法

由斜面接一環(huán)到50mL(250mL的三角瓶）的種子培養(yǎng)基中，于31℃、230 r/min 的恒溫搖床培養(yǎng)13h，制成液體菌種，然后按2%的接種量接入到裝液量為35mL(250mL的三角瓶)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在31℃、230r/min的條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 Plackett-Burman設(shè)計優(yōu)化

采用多因素二水平的Plackett－Burman試驗設(shè)計方法，對培養(yǎng)基各成分進行顯著性篩選，并進行排序，以期獲得三個顯著性因素，進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化[2,3]。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面分析法的BOX-Behnken設(shè)計，對三個顯著性因素進行優(yōu)化，優(yōu)化三個因素的最佳水平點，獲得最佳優(yōu)化配方，同時驗證[2,3]。

1.2.4 蛋白酶活力的測定

采用酪蛋白（SIGMA產(chǎn)品）為底物，采用紫外分光度法進行測定[4]。酶活力單位定義：在pH 7.2、50℃的條件下每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選重要因素

采用Plackett-Burman實驗設(shè)計對培養(yǎng)基配方各組分（包括：黃豆粉，葡萄糖，酵母膏，K2HPO4，ZnSO4·7H2O，MnSO4·H2O，CaCO3，初始pH）進行重要性篩選，確定對產(chǎn)酶影響顯著的因素。選擇=12的8因素2水平的Plackett- Burman試驗設(shè)計，進行培養(yǎng)基優(yōu)化。以發(fā)酵培養(yǎng)基配方的不同組分作為優(yōu)化輸入因子，輸入因子1～8分別代表黃豆粉，酵母膏，葡萄糖，K2HPO4，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O，MnSO4·H2O，CaCO3，pH，每項均取低(-1)和高(+1)兩水平，見表1，響應(yīng)值為蛋白酶的酶活力，表中每列代表每種因素的不同水平。

表1 N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計方案及試驗響應(yīng)值

Plackett-Burman試驗的二水平分析目的：在其它因素不變的情況下，分析某因素的變化對響應(yīng)的影響，從而得出影響培養(yǎng)基組成的主效應(yīng)因素，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：培養(yǎng)基成分葡萄糖、酵母膏、初始pH以及ZnSO4·7H2O可信度均大于88.47%，為顯著因子，顯著性排序為葡萄糖>酵母膏>初始pH>ZnSO4·7H2O。

表2 Plackett- Burman試驗設(shè)計因素水平及顯著性

2.2 響應(yīng)面BOX-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果

從一階試驗設(shè)計Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果獲得進入二階試驗設(shè)計的三因素：酵母粉、葡萄糖和ZnSO4三個顯著因子，將三因素設(shè)定三水平(-1,0,1)，各水平設(shè)計見表3，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，為三因素三水平15個試驗點，實施設(shè)計后得到試驗數(shù)據(jù)，進行二次回歸擬和，得到交互項和平方項的二次方程，分析因素之間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，求得三因素的最佳水平組合[5,6]。由表4可見，試驗實測值與模擬值之間誤差較小，擬和較好。

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化的因素和水平

表4 BOX-Behnken設(shè)計矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實測值與擬合值

2.2.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立

利用SAS統(tǒng)計軟件的二次響應(yīng)面回歸（RSREG）進行數(shù)據(jù)分析，參數(shù)估計值見表5，建立得到擬合二次回歸方程如下：

方程回歸分析及方差分析見表5。回歸方程的決定系數(shù) R2=0.9071 ，說明該二次回歸方程的擬合程度較好，總模型回歸值為0.038566，說明模型回歸顯著；方差分析顯示，線性回歸、二次回歸值小于0.05，均為顯著，因此該模型可以用于FS42產(chǎn)耐熱蛋白酶發(fā)酵優(yōu)化的理論預(yù)測。

表5 回歸方程方差分析表

2.3 發(fā)酵優(yōu)化最佳配方組合的獲得及驗證

在獲得非線性回歸模型和響應(yīng)面之后，為了求得培養(yǎng)基最佳濃度,對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0得到三元一次方程組，求解此方程組可以得到最大產(chǎn)酶量時的最佳條件[5,6]。即:1=0.83（5.43g/L），2= -0.11（4.24g/L），3=1.33（0.39g/L），=6441.51，也即三因素最佳組合為：葡萄糖5.43g/L 、酵母膏4.24g/L、ZnSO4為0.39g/L，此條件下理論預(yù)測最大酶活力為6441.51U /mL。

回歸模型試驗驗證：根據(jù)此優(yōu)化組合進行試驗驗證得到實際酶活力為6473 U/mL，實測值比預(yù)測值誤差0.49%，可見該模型較好地預(yù)測了試驗結(jié)果，說明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基可行有效。

3 結(jié)論

本文對蘇云金芽孢桿菌FS42產(chǎn)耐熱蛋白酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。通過Plackett-Burman設(shè)計對FS62發(fā)酵培養(yǎng)基的8個因素：葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3和初始pH值進行重要性篩選，篩選到3個重要因素，即酵母粉、葡萄糖和ZnSO4。用BOX-Behnken試驗設(shè)計對它們的配比進行3因素3水平試驗設(shè)計優(yōu)化。利用SAS軟件進行響應(yīng)面回歸分析得到相應(yīng)的回歸方程，并由此獲得最優(yōu)的濃度配比值，得到優(yōu)化后的最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)為:黃豆餅粉12、酵母膏4.3、葡萄糖5.42、KH2PO42、ZnSO40.39、MnSO40.42。經(jīng)試驗，優(yōu)化后產(chǎn)酶水平顯著提高，達到6473U/mL，與RSM預(yù)測值誤差僅為0.49%，達到試驗預(yù)期目標。

[1] 鄭毅, 周虓, 黃勤清, 關(guān)雄. 產(chǎn)耐溫蛋白酶蘇云金芽孢桿菌FS140液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2007, 13(5):708-712.

[2] 鄭毅, 朝科, 張志國. 利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法快速優(yōu)化木聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 生物數(shù)學(xué)學(xué)報,2008, 23(1):143-150.

[3] 陳寧, 常高峰, 張克旭. L-異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(2):33-37.

[4] 張寒俊, 劉大川, 楊國燕. 紫外光譜法定量測定不同種蛋白酶活力的研究[J]. 糧食與飲料工業(yè), 2004 (9):44-45.

[5] 鄭毅, 劉源慧, 鄧琳芬. 響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉α-淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 海峽科學(xué), 2010(10):3-14.

[6] 劉忠, 楊文博, 孫丹, 白鋼, 金永杰. 酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J]. 南開大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2004, 37(1):83-87.