馮婷 李峰 宋月晗 劉曉蘭 馬捷 毛萌 吳鳳芝 劉晶

睡眠的作用是調(diào)節(jié)丘腦—皮層以及海馬—新皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元之間同步化作用，可以根據(jù)神經(jīng)元的活動性來促進(jìn)不同程度的突觸效應(yīng)，將短時記憶碎片再次激活、分析，并逐漸組合，融合成長時程記憶。不同時間的睡眠剝奪對學(xué)習(xí)記憶有不同程度的影響，對動物進(jìn)行中長期睡眠剝奪能顯著造成學(xué)習(xí)記憶障礙，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為第二個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子也參與長時程增強(qiáng)的產(chǎn)生和維持。本實驗通過疏肝補(bǔ)腎方藥干預(yù)睡眠剝奪造成學(xué)習(xí)記憶障礙，觀察BDNF的蛋白表達(dá)，研究疏肝補(bǔ)腎法的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體重(270±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK(京)2006-0009。飼養(yǎng)于室內(nèi)溫度(22±2)℃、相對濕度在30%～40%的動物房，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00～18∶00)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，期間自由飲水、進(jìn)食，同時進(jìn)行站平臺訓(xùn)練。隨機(jī)將大鼠分為3組，每組12只，分別為對照組(正常環(huán)境飼養(yǎng))、模型組(睡眠剝奪)、疏肝補(bǔ)腎治療組(模型組基礎(chǔ)上給予四逆散和生慧湯合方)。

1.2 動物模型制備

采用改良的多平臺(MMPM)睡眠剝奪法[1]復(fù)制模型，將模型組和疏肝補(bǔ)腎治療組從造模第1天早8∶00開始放入睡眠剝奪箱，連續(xù)7天，至第8天早8∶00結(jié)束。使用自制睡眠剝奪箱，規(guī)格110 cm(長)×60 cm(寬)×40 cm(高)，塑料箱內(nèi)壁為灰色，其底面均勻固定15個直徑6.5 cm、高8 cm的有機(jī)玻璃平臺。造模開始前在箱內(nèi)注水，水平面應(yīng)在平臺下1 cm處，水溫保持在28～30℃。箱頂置鐵絲網(wǎng)，大鼠在平臺間可自由活動和飲食。

1.3 藥物制備與給藥方法

疏肝補(bǔ)腎治療組采用四逆散和生慧湯的1∶1合方。四逆散：選用《傷寒論》的四逆散(由柴胡、枳實、赤芍、炙甘草各6 g組成)；生慧湯：選用《辨證錄·健忘門》的生慧湯(由熟地黃30 g、遠(yuǎn)志6 g、山茱萸12 g、柏子仁15 g、菖蒲1.5 g、炒棗仁15 g、茯苓9 g、紅參9 g、白芥子6 g組成)。方藥均為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供的免煎顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，按人體用藥量換成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量，每天給予生藥量為13.38 g/kg，灌胃容積1 ml/kg，時間點(diǎn)為睡眠剝奪的4、28、52、76、100、124、148小時。對照組和模型組同時間給予等體積蒸餾水。

1.4 試劑

抗原修復(fù)液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，ABC試劑盒(VECTOR公司，美國)，BDNF兔來源多克隆抗體(Abcam公司，美國)，DAB試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.5 學(xué)習(xí)記憶評定

采用Y迷宮評定大鼠的記憶能力。各組造模前3天進(jìn)行每天20次的訓(xùn)練，取第3天成績，造模最后一天再進(jìn)行測試。設(shè)備由三等分迷路箱和控制儀組成。迷路箱為等長的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界區(qū)；箱底鋪設(shè)間距1 cm的電柵，每臂頂端各裝一盞15 W的刺激信號燈。Y迷宮的控制儀有電壓控制按鈕、延時控制按鈕和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四個按鈕，當(dāng)分別按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應(yīng)臂的信號燈亮，此時該臂不通電為安全區(qū)，另外無燈光的兩臂及交界區(qū)均通電而成為非安全區(qū)；按下0按鈕，則三臂均不通電，但交界區(qū)通電，信號燈亮后，稍停片刻電柵才開始通電[2]。根據(jù)文獻(xiàn)研究，本實驗采用“固定次數(shù)隨機(jī)不休息法”[3]，實驗時先將大鼠放入迷宮適應(yīng)3分鐘，然后無規(guī)則變換安全區(qū)次序，大鼠受電擊后逃到安全區(qū)，燈光持續(xù)10秒，然后再以所在臂作為下次測試的起始位置進(jìn)行下一次測試。每個實驗日連續(xù)測試20次，連續(xù)10次中有9次或者以上正確反應(yīng)，則為達(dá)標(biāo)。本實驗每組篩選出9只進(jìn)行測試。所用參數(shù)：電壓50～70 V，延時5秒。

1.6 血清SOD檢測

造模結(jié)束后，用10%水合氯醛溶液以0.3 ml/100 g體重腹腔麻醉，斷頭取血，置于冰上，使用4℃低溫離心機(jī)以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取得上清置于Eppendorf管中﹐保存于-20℃冰箱待用。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。每組選取9只離心效果好的血清進(jìn)行檢測。

1.7 前額葉皮質(zhì)區(qū)BDNF蛋白檢測

1.7.1 組織切片 造模結(jié)束麻醉后，于冰上取每組半數(shù)大鼠的全腦，去除嗅球及小腦后，用液氮迅速冷凍，待腦組織變白置于-80℃冰箱待用。從-80℃冰箱取出組織，在-20℃冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行組織切片，參考腦部定位圖譜在前額葉皮質(zhì)區(qū)連續(xù)切片，厚度為8 μm，貼于載玻片，在混合固定液[4]中固定切片5分鐘后放置于-20℃冰箱待用。

1.7.2 免疫組化檢測 從-20℃冰箱取出冰凍切片，室溫平衡2分鐘，按照說明采用微波熱修復(fù)法置于抗原修復(fù)液(1∶100)中進(jìn)行修復(fù)，待修復(fù)液自然冷卻至室氣溫，將玻片取出，PBS漂洗3分鐘×3次，去離子水沖洗；以0.3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶(室溫、避光、30分鐘)，PBS漂洗5分鐘×3次；羊血清封閉(3∶200、37℃、30分鐘)；傾去多余血清，滴加BDNF兔來源的多克隆一抗(1∶60、4℃過夜)，PBS漂洗5分鐘×3次；滴加二抗(1∶200,37℃，45分鐘)，PBS漂洗5分鐘×3次；滴加A、B液(1∶100，37℃，45分鐘),PBS漂洗5分鐘×3次；DAB顯色(1∶20)，顯色過程中可一邊觀察腦片陽性物質(zhì)的顯色情況，最后進(jìn)行上行酒精脫水、二甲苯透明，封片，鏡下觀察、照相，每組隨機(jī)抽取3只大鼠，每只大鼠每個部位9個視野，應(yīng)用NIS-Elements BR 3.1軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以平均光密度值表示蛋白表達(dá)相對量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮測試結(jié)果

Y迷宮結(jié)果顯示，造模前最后一次各組間錯誤反應(yīng)次數(shù)和主動回避率基本無差異。造模第7天，從錯誤反應(yīng)次數(shù)顯示，與對照組比較，模型組明顯增多，有非常顯著差異(P<0.01)，疏肝補(bǔ)腎治療組也多于對照組，有顯著差異(P<0.05)；與模型組比較，疏肝補(bǔ)腎治療組的錯誤反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。主動回避率結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組降低，具有非常顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補(bǔ)腎治療組增多，差異非常顯著(P<0.01)。說明睡眠剝奪對機(jī)體產(chǎn)生明顯的學(xué)習(xí)記憶力障礙，疏肝補(bǔ)腎方藥可調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

表1 各組大鼠造模第0、7天測試結(jié)果

注：與對照組比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.01。

2.2 血清SOD含量

結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組SOD的含量減少，差異非常顯著(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補(bǔ)腎治療組SOD含量明顯增多，差異非常顯著(P<0.01)。說明睡眠剝奪后機(jī)體的SOD不能有效的消除應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基，機(jī)體組織細(xì)胞損傷明顯加重，而疏肝補(bǔ)腎中藥能顯著增多SOD的含量。見表2。

表2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的對比

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

2.3 前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)變化

在冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測中，BDNF陽性反應(yīng)物呈圓形、軟圓形或梭形顆粒，染色為棕黃色，分布在胞漿中，所有陰性對照切片均無特異性著色。比較BDNF陽性反應(yīng)物平均密度值，模型和疏肝補(bǔ)腎治療組與對照組相比明顯減少，具非常顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補(bǔ)腎治療組陽性反應(yīng)物增多，具有非常顯著差異(P<0.01)。說明睡眠剝奪減少BDNF在前額葉皮質(zhì)的蛋白表達(dá)，而疏肝補(bǔ)腎治療組能顯著調(diào)節(jié)BDNF的減少趨勢。見表3、圖1。

表3 大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF免疫陽性反應(yīng)物的變化

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖1 各組冰凍切片大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)

3 討論

BDNF廣泛存在于腦的各個區(qū)域，以大腦皮層和海馬居多。在成年中樞系統(tǒng)，BDNF的表達(dá)受一系列因素的調(diào)節(jié)，也表現(xiàn)為以活動依賴性的方式。它是一個重要的能夠調(diào)節(jié)突觸可塑性，從而影響學(xué)習(xí)記憶的中介[5]，BDNF依賴性信號傳導(dǎo)途徑通過活化TrkB受體，使水解磷脂酶C、磷脂酰環(huán)己六醇激酶-3、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、促細(xì)胞分裂活性蛋白激酶等的信號通路激活，通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+發(fā)揮作用，且也調(diào)節(jié)BDNF、TrkB mRNA的轉(zhuǎn)化和蛋白向樹突的運(yùn)輸，這些機(jī)制是負(fù)責(zé)蛋白翻譯并調(diào)節(jié)突觸傳遞和突觸形成，從而增強(qiáng)和維持學(xué)習(xí)記憶功能[6]。Mizun等[7]實驗提出BDNF-TrkB信號通路與N-甲基-D-天冬氨酸(NDMA)受體存有內(nèi)在聯(lián)系，這種聯(lián)系在海馬空間記憶中起到了重要作用。

實驗結(jié)果證明，與對照組比較，模型組Y迷宮成績下降，血清SOD水平降低，前額葉皮質(zhì)BDNF免疫陽性物質(zhì)表達(dá)顯著減少，說明中長期睡眠剝奪能造成腦損傷，有可能通過BDNF介導(dǎo)的神經(jīng)通路影響突觸可塑性；經(jīng)過疏肝補(bǔ)腎方藥的干預(yù)，與模型組比較，SOD增多，氧自由基對腦功能損傷的趨勢減弱，Y迷宮學(xué)習(xí)成績提高，同時BDNF在前額葉皮質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，說明同時應(yīng)用疏肝法和補(bǔ)腎法能調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝狀態(tài)，保護(hù)腦功能，并通過誘發(fā)長時程增強(qiáng)增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。在以往的研究中，多采用安神、補(bǔ)腦、補(bǔ)腎、益氣的方法改善睡眠剝奪等應(yīng)激后所致的學(xué)習(xí)記憶能力障礙，本研究考慮到，睡眠剝奪作為一種目前生活中常見的應(yīng)激方式，肝主疏泄功能的影響貫穿整個造模過程中，可以認(rèn)為是一種主要的影響因素，所以本實驗設(shè)計運(yùn)用疏肝、補(bǔ)腎結(jié)合的方法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善。

睡眠剝奪模型模擬的是“想睡而不能睡”的病因病理過程，大鼠在睡眠剝奪箱內(nèi)雖然可以自由活動、飲食，因受水的刺激，欲逃竄的心理很明顯，在筆者相關(guān)試驗中也發(fā)現(xiàn)，大鼠在睡眠剝奪期間的攻擊性增強(qiáng)。根據(jù)中醫(yī)理論，肝主疏泄、調(diào)暢氣機(jī)，“所欲不得”，氣血運(yùn)行不暢，諸陽氣會諸于頭，氣機(jī)失調(diào)則腦失濡養(yǎng)而影響神經(jīng)相關(guān)功能，所以通過疏肝調(diào)暢氣機(jī)，肝腎同源，又腎主骨生髓，腦為髓海，疏肝的同時予以補(bǔ)腎，則髓海充養(yǎng)，學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)。

針對實驗所復(fù)制的造模方法，本研究首先選用《傷寒論》中的四逆散以疏肝郁、調(diào)暢氣機(jī)，正如《素問·四時刺逆從論》所述“血?dú)馍夏?，令人善忘”，陳士鐸在《辨證錄》中所說“氣郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不記憶，乃肝氣之滯”，并結(jié)合具有補(bǔ)腎養(yǎng)心作用的生慧湯，通過肝、心、腎的交互作用，說明睡眠剝奪過程及造成學(xué)習(xí)記憶障礙的證候。應(yīng)用疏肝補(bǔ)腎方藥調(diào)節(jié)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，影響B(tài)DNF的分布和表達(dá)，該通路其他遞質(zhì)、受體是否也參與對LTP的調(diào)節(jié)，待后續(xù)研究。

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