張 燕 常保超 陳衛(wèi)東

目前，糖尿病腎病(DN)導致慢性腎衰竭已十分常見，其病理改變多表現(xiàn)為彌漫性腎小球硬化、腎小球結節(jié)性硬化，腎間質(zhì)纖維化等。與腎小球病變相比，腎間質(zhì)纖維化更能反映腎功能減退的程度，決定患者預后［1］。轉化生長因子 β1(TGF－β1)是重要的促纖維化因子，拮抗TGF－β1的抗纖維化因子骨形成蛋白 7(BMP－7)及 BMP－7的內(nèi)源性拮抗劑Gremlin在體內(nèi)失衡是引起腎間質(zhì)纖維化的重要機制。雷公藤多苷(TW)因具有獨特的抗炎作用被應用于臨床治療DN，但其是否具有抗纖維化作用研究較少。本研究通過高糖高脂飲食，并以鏈脲佐菌素腹腔注射建立DN大鼠模型，觀察腎組織損傷過程中 TGF－β1、BMP－7 及 Gremlin 的表達變化，進一步了解DN腎間質(zhì)纖維化的機制，應用TW進行干預治療，以探討其在防治腎間質(zhì)纖維化的作用。

對象與方法

實驗動物與分組 清潔級雄性SD大鼠40只，體重180～200g(購自蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心)，隨機分為實驗組(30只)及對照組(10只)，適應性喂養(yǎng)1周，測鼠重進入實驗。造模組予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素;對照組予以基礎飼料喂養(yǎng)，腹腔注射枸橡酸鹽緩沖液。72h后采血測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。將成功造模的26只大鼠隨機分為DN組13只，每日以生理鹽水灌胃;TW治療組13只，每日以TW 50 mg/(kg·d)灌胃，用藥16周。

主要試劑 兔抗大鼠TGF－β1多克隆抗體、兔抗大鼠BMP－7多克隆抗體、兔抗大鼠Gremlin多克隆抗體、羊抗兔二抗均購自北京奧博森生物技術有限公司。Trizol、逆轉錄酶、引物均購自上海生物工程公司。TW片劑由上海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

觀察方法

一般情況 每天觀察各組大鼠精神、飲食、飲水、皮毛色澤及活動情況。

尿蛋白定量及尿N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(NAG) 在造模前及造模后第2、4、8、16周測量鼠重，并將大鼠放入代謝籠中，禁食、自由飲水，收集24h尿。免疫比濁法測定24h尿蛋白定量，用分光光度法測量尿NAG。

血清生化、腎組織的采集及檢驗 16周處死動物，處死時心臟采血3 ml用于生化檢驗。取血后，摘取腎臟，右腎生理鹽水洗去血跡后稱重，液氮速凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。左腎放入10%中性甲醛中固定備檢。氧化酶法測定血糖，采取自動生化分析儀測定血清白蛋白(Alb)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)。

腎組織病理檢查 (1)組織學:將10%中性甲醛固定的腎組織石蠟包埋的常規(guī)組織切片，HE染色，觀察腎組織病理變化。腎間質(zhì)纖維化定量分析借助HMIAS－2000高清彩色病理報告分析系統(tǒng)，每個標本在光鏡200倍視野下分別觀察10個不含腎小球的皮質(zhì)視野。計算纖維化面積占整個視野的百分比。腎間質(zhì)浸潤的炎癥細胞計數(shù)在400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不含腎小球的視野，計數(shù)腎間質(zhì)內(nèi)浸潤的炎癥細胞(單核巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞)，結果以(炎癥細胞數(shù)/高倍視野×400)表示［2］。(2)免疫組織化學染色:常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理，微波修復抗原后滴加封閉液，滴加兔抗大鼠TGF－β1多克隆抗體、兔抗大鼠 BMP－7多克隆抗體、兔抗大鼠Gremlin多克隆抗體。次日加生物素化，山羊抗兔IG在37℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素復染。陰性對照組以PBS緩沖液代替一抗。每個標本隨機抽取10個高倍視野下，計算陽性細胞的百分比。

腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin 核酸表達 以RT－PCR 檢測 TGF－β1、BMP－7、Gremlin 核酸表達。取各組大鼠腎皮質(zhì)0.1g，用TRIzol抽提總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的濃度及純度(A260/280值在 180～200之間)。取 5 μg總 RNA，按照M－MLV Reverse Transcriptuse試劑盒說明書進行逆轉錄合成CDNA，取適量CDNA在PCR擴增儀上進行擴增，反應總體積為50 μl。MNCBI的Nucleotide中查得目的基因和內(nèi)參照基因，采取Primer Express Sofware設計，由上海生物工程公司合成。

TGF－β1:上游 5＇－GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA－3＇，下游 ＇5＇－GAAGCGAAAGCCCTGTATTCC－3＇。擴增產(chǎn)物長度242 bp;擴增條件為94℃度預變性2 min，94℃變性 30s，54℃退火 30s，72℃延伸 40s，經(jīng) 30 個循環(huán)后，72℃再延伸8 min。

BMP－7:上游 5＇GTAGCGCGTAGAGCCG－3＇，下游＇5＇－CGAGTCCGTGCATGG－3＇。擴 增 產(chǎn) 物 長 度 345 bp，擴增條件為94℃度預變性2 min，94℃變性30s，57.1℃退火30s 72℃延伸40s，經(jīng)35個循環(huán)后72℃再延伸8 min。

Gremlin:上游 5＇－AGGTTCCCAAGGAGCCATTC－3＇，下游 ＇5＇－GATATGCAACGGCACTGCTT－3＇。擴增產(chǎn)物長度275 bp，擴增條件為94℃度預變性2 min，94℃變性 30s，61℃退火 30s，72℃延伸 40s，經(jīng) 30 個循環(huán)后72℃再延伸8 min。

內(nèi)參 GAPDH:上游 5＇－GAGAGGGAAATCGTGCG TGAC－3＇，下 游 ＇5＇－CATCTGCTGGAAGGTGGACA－3＇。擴增產(chǎn)物長度453 bp，擴增條件為94℃度預變性2 min，94℃變性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸40s，經(jīng)30個循環(huán)后72℃再延伸8 min。

取PCR產(chǎn)物5 μl與上樣緩沖液充分混勻后，于5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線透射檢測儀上，在紫外燈下照相，再以Labworks軟件進行光密度掃描。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)密度作為參考值標準對照，比值表示核酸相對表達量。

腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin 蛋白表達 以Western blotting 檢測腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin蛋白表達，將腎組織加入裂解液中，提取總蛋白后，測定蛋白濃度。蛋白樣本在100℃變性5 min，各取樣本20 μl，進行 SDS－PAGE 凝膠電泳。電泳結束后，電轉移至PVDF膜，在含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1h。加入兔抗大鼠多克隆抗體TGF－β1(1∶100)、兔抗大鼠多克隆抗體BMP－7(1∶200)和兔抗大鼠多克隆抗體Gremlin(1∶200)，4℃過夜，洗膜后與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃下孵育1h。取出PVDF膜，置于DAB顯色液顯色、定影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行電泳條帶光密度掃描分析，以靶蛋白條帶光密度與內(nèi)參照條帶光密度的比值作為蛋白的各組相對表達量，予以統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以(ˉx±s)表示，尿蛋白定量和尿NAG在三組間和造模前后不同時間點變化的比較采用兩因素多水平重復測量資料的方差分析;其他指標的平均水平及腎組織病理改變在三組間的比較用完全隨機設計單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗;采用Pearson直線相關分析腎組織TGF－β1與Gremlin表達的關系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

實驗組30只大鼠中2只造模失敗，2只因血糖過高死亡，共26只進入實驗，后因感染死亡3只。最終進入統(tǒng)計分析的大鼠DN組11只，TW組12只，對照組10只。DN模型組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍，食欲下降、體重減輕，毛發(fā)雜亂無光澤。TW干預后上述情況有所改善，第16周TW組大鼠體重(416.35±72.26)g與DN組(388.26±53.07)g及對照組(543.23±36.92)g比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

各組大鼠尿蛋白、尿NAG比較 在鏈脲佐菌素腹腔注射2周后模型組動物尿蛋白增加，至4周達到頂峰，此后一直保持較高水平，兩組大鼠尿蛋白變化趨勢基本一致，但TW組低于DN組，在第4、8、16周時均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)(表1)。DN組及TW組早期出現(xiàn)尿NAG升高，與對照組比較在第2、4、8、16周均有統(tǒng)計學差異;TW組尿NAG水平顯著低于DN組(P＜0.01)(表2)。

各組生化指標改變見表3，第16周時與正常對照組相比，模型組隨機血糖、SCr、BUN明顯升高，Alb降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。TW組SCr和BUN顯著低于DN組(P＜0.01)，Alb顯著高于后組(P＜0.01)。

腎組織病理改變 對照組腎小球、腎小管結構正常;DN組腎小球面積和腎小球體積增大，腎小球毛細血管袢基膜增厚，系膜區(qū)系膜細胞增多、基質(zhì)增生，部分大鼠出現(xiàn)局灶腎小球硬化性改變;腎小管上皮細胞渾濁、空泡樣變，部分上皮細胞壞死，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生，局灶性纖維化。TW組較DN組病變輕，部分腎小球毛細血管袢基膜增厚，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤及纖維化較少(P＜0.01)(表4)。

表1 各組大鼠尿蛋白定量(mg/24h)的變化

表2 各組大鼠尿NAG(U/L)變化

表3 第16周各組實驗大鼠血糖生化指標的變化

表4 各組腎組織病理的改變

腎組織 TGF－β1、BMP－7 和 Gremlin 免疫組化及蛋白的表達 16周時，TGF－β1、Gremlin在對照組腎小管有少量表達，均呈胞漿陽性;DN組及TW組腎小管 TGF－β1、Gremlin的表達明顯增加(P ＜0.01)。與DN組比較，TW組的兩者表達量下降(P＜0.01)。Western blotting法檢測腎組織 TGF－β1、Gremlin的蛋白表達也顯示同樣的變化趨勢(P ＜0.01)(表5、6，圖 1、2)。

各組腎組織均有BMP－7表達，主要位于腎小管和集合管，呈胞質(zhì)表達陽性，DN組及TW組BMP－7的表達低于對照組。與DN組相比，TW組BMP－7表達增多(P＜0.01)。Western blotting法檢測腎組織BMP－7的蛋白表達，與對照組比較DN組明顯下調(diào)，TW干預后BMP－7 蛋白增加(P ＜0.01)(表5、6，圖1、2)。

腎組織 TGF－β1、BMP－7 和 Gremlin 的核酸表達與對照組比較，DN組和TW組腎組織TGF－β1和Gremlin核酸表達上調(diào)，但 TW組低于 DN組(P＜0.01)。與對照組比較，DN組和TW組BMP－7核酸表達下調(diào)，但TW組高于DN組(P＜0.01)(表7、圖 3)。

腎組織TGF－β1與Gremlin表達的關系 兩者在免疫組化、核酸和蛋白表達的相關系數(shù)r分別為0.898、0.648和0.855，說明兩者的表達呈正相關(P ＜0.01)。

表5 腎組織免疫組化TGF-β1、BMP-7和Gremlin陽性細胞百分比(%)

表6 腎組織TGF-β1、BMP-7和Gremlin蛋白的表達

表7 腎組織TGF-β1、BMP-7和Gremlin的核酸表達

圖1 糖尿病腎病組、雷公藤多苷治療組及對照組大鼠16周腎組織形態(tài)學變化及 TGF-β1、BMP-7和Gremlin表達

圖2 各組大鼠腎組織 TGF-β1、BMP-7和 Gremlin的蛋白表達

圖3 各組大鼠腎組織 TGF-β1、BMP-7和 Gremlin的核酸表達

討 論

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進展到終末期腎病的共同結果。蛋白尿是DN腎小球損傷的標志，同時也是加重腎臟損害的因素［3］。Morii等［4］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿在腎小管損傷方面發(fā)揮了更加重要的作用。進入腎小管中的蛋白質(zhì)及前免疫介質(zhì)加重腎小管上皮細胞負荷并促進腎小管上皮細胞釋放各種炎癥因子、趨化因子［如單核細胞趨化因子1(MCP－1)］等，使腎間質(zhì)單核/巨噬聚集、導致小管間質(zhì)炎性反應。刺激原基質(zhì)成纖維細胞和經(jīng)上皮間葉轉化來的肌纖維細胞增生，腎間質(zhì)纖維化［5，6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，DN早期大鼠尿蛋白定量增加，腎小管上皮細胞受損，尿NAG升高，并隨病程進展加重，16周時可見腎小管上皮細胞渾濁、空泡樣變和壞死，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤。既往體外實驗證實雷公藤甲素可穩(wěn)定足細胞的骨架結構，逆轉足細胞的損傷，恢復足細胞骨架結構和相關分子的表達，從而減少尿蛋白［7］。雷公藤具有抑制T細胞及B細胞的活化，誘導活化的T細胞、樹突細胞凋亡，抑制IL－1α、IL－1β、MCP－1 等炎癥因子的合成，抑制腎小管上皮細胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等廣泛抗炎、抑制免疫作用，本研究中經(jīng)TW干預后，大鼠尿蛋白明顯減少，尿NAG下降，病理顯示腎小管損害減輕，炎癥細胞浸潤減少，說明TW可以減輕尿蛋白，改善腎小管的損傷，抑制炎癥，從而改善腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展。

細胞因子與DN腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化密切相關。TGF－β1是纖維化的中心環(huán)節(jié)，參與成纖維細胞的活化、增生和表型轉化及細胞外基質(zhì)增多的過程［8］。BMP－7是轉化生長因子超家族中的一員，它調(diào)控細胞的生長、分化、趨化及凋亡。能夠阻斷TGF－β1信號，逆轉上皮細胞向間質(zhì)細胞轉化(EMT)［9］，誘導間質(zhì)成纖維細胞向上皮細胞分化(MET)［10］，拮抗 TGF－β1 誘導的間質(zhì)成纖維細胞發(fā)生表型轉化成α平滑肌肌動蛋白(α－SMA)的肌成纖維細胞［11］，逆轉 TGF－β1 的促纖維化作用。在DN早期高糖、尿蛋白、多種細胞因子的作用下，腎組織TGF－β1/Smad2/3促纖維化信號轉導途徑被激活［12，13］，BMP－7 的表達下降，與腎間質(zhì)纖維化密切相關。外源性重組BMP－7能夠改善腎小管間質(zhì)纖維化，并與劑量正相關［14］。

我們觀察16周DN大鼠腎組織TGF－β1的免疫組化、核酸及蛋白表達異常增高，BMP－7的免疫組化、核酸及蛋白表達下降，腎間質(zhì)纖維結蹄組織增生明顯、局灶纖維化。DN發(fā)生發(fā)展過程中不僅高血糖、高血脂等代謝因素促進腎組織TGF－β1的表達，炎癥趨化因子MCP－1使得單核巨噬細胞在局部浸潤增生，進一步促進 TGF－β1的高表達［15］。而雷公藤作為一種免疫抑制劑，很低濃度的雷公藤甲素即能抑制脂多糖(LPS)刺激的樹突細胞產(chǎn)生MCP－1的生成［16］，抑制腎小管上皮細胞的抗原遞呈功能［17］，抑制腎小管上皮細胞表達MCP－1［18］，從而起到減少TGF－β1的產(chǎn)生，基于上述的研究結果，我們采用TW干預。治療后TGF－β1的免疫組化、核酸及蛋白表達增高趨勢被抑制，BMP－7核酸、蛋白增加，腎組織纖維化減輕。說明TWP能夠下調(diào)TGF－β1表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，上調(diào)BMP－7的表達，從而改善腎間質(zhì)纖維化。

BMP－7的腎臟保護作用，不僅取決于其本身，還與其激動劑和拮抗劑之間的復雜平衡有關［19］。TGF－β1和BMP－7在腎纖維化的過程中相互拮抗，但TGF－β1并非 BMP－7受體的配體，本身不調(diào)節(jié)BMP－7表達及信號傳導，而是通過正向調(diào)節(jié)其下游因子 BMP－7的內(nèi)源性拮抗劑 Gremlin發(fā)揮作用的［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)Gremlin在 DN 腎組織表達是增加的，并與腎間質(zhì)纖維化及腎功能減退相關［22，23］。外源性端粒酶抑制Gremlin表達可以減輕腎間質(zhì)纖維化［24］。

我們還發(fā)現(xiàn)，DN腎組織Gremlin的核酸及蛋白表達明顯升高，且主要在腎小管表達，與TGF－β1的表達具有正相關性，這說明TGF－β1可以正向調(diào)節(jié)Gremlin的表達。DN發(fā)展過程中過度表達的TGF－β1上調(diào)Gremlin的產(chǎn)生，拮抗BMP－7的抗纖維化，而TW抑制TGF－β1的產(chǎn)生，從而下調(diào)Gremlin了的表達，改善腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，本研究闡明了TW通過減少蛋白尿、保護腎小管上皮細胞、抑制炎癥，下調(diào)促纖維化因子TGF－β1及下游因子Gremlin的表達，上調(diào)抗纖維化因子BMP－7的表達，從而改善腎間質(zhì)纖維化。但是，Gremlin并不調(diào)節(jié)BMP－7的產(chǎn)生，因此TW增加BMP－7表達機制的研究有待進一步完善。

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