王旭方 李夢婕 葛永純 秦衛(wèi)松 阿基業(yè) 侯金花 謝紅浪 王廣基 劉志紅

隨著飲食和生活方式的改變，我國2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生率逐漸升高。糖尿病腎病(DN)在腎活檢患者中的檢出率也逐年上升［1］，成為終末期腎病(ESRD)的重要原因之一。DN患者臨床上一旦出現(xiàn)腎功能不全，其病情進(jìn)展迅速，預(yù)后差［2］，因此早期診斷十分重要。目前DN早期篩查主要依據(jù)尿微量白蛋白，但很多研究表明，尿微量白蛋白正常者，其腎小球濾過率(GFR)已經(jīng)出現(xiàn)顯著下降［3］，因此尿微量白蛋白對于DN早期診斷的敏感性并不高。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個重要領(lǐng)域，能通過核磁共振或質(zhì)譜法定性和定量檢測不同代謝通路的小分子代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，并行組間差異分析，反映機(jī)體疾病狀態(tài)下代謝水平改變［4］。DN患者體內(nèi)存在糖、脂和氨基酸代謝等多種代謝通路異常［5］，其中，線粒體氧化應(yīng)激引起糖代謝的多元醇通路、糖基化終產(chǎn)物形成(AGEs)、蛋白激酶C(PKC)通路和己糖胺通路異?；罨谀I組織損傷中起重要作用［6］。目前尚沒有研究系統(tǒng)性觀察DN患者上述代謝通路的變化特征。因此，本研究采用氣相色譜/質(zhì)譜(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)和液相色譜/質(zhì)譜(liquidchromatography/mass spectrometry，LC/MS)法觀察不同時期T2DN患者血清和尿液糖、脂、氨基酸等小分子代謝產(chǎn)物的變化，并用于發(fā)現(xiàn)DN早期診斷的生物標(biāo)志物。

對象與方法

病例選擇 選取2009年6月至2011年5月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所臨床確診的男性T2DM患者，依據(jù)尿蛋白水平分為三組，即尿白蛋白正常組［尿白蛋白排泄率(UAER)＜17 mg/24h］;微量白蛋白尿組(100 mg/24h＜UAER ＜300 mg/24h);蛋白尿組(尿蛋白1～3 g/24h)。每組30例患者，并滿足以下條件:年齡30～65歲，無肉眼血尿(尿沉渣紅細(xì)胞＜100/μl);排除合并心臟、肝膽、甲狀腺疾病及腎功能不全患者，排除近3月體重改變＞10%的患者，可伴或不伴高血壓、血脂代謝異常。選取年齡匹配的健康成年男性25例為對照，均無肥胖、高血壓、糖脂代謝紊亂等病史。所有患者禁食12h，記錄尿液體積，留取清晨空腹血清、中段尿標(biāo)本，－80℃保存待測。

試劑和儀器 甲基肉蔻酸、鹽酸甲氧胺、甲基硬脂酸(均購于 Sigma－Aldrich);系列烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液(C8－C40，F(xiàn)luka);吡啶(Fluka);N－甲基－N－(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS，Pierce);甲醇(Tedia);正庚烷(Merck)。島津GC/MS聯(lián)用儀(GCMS－QP2010);島津液相色譜儀(Prominence UFLCXR);AB SCIEX TripleTOFFM5600質(zhì)譜儀;減壓濃縮裝置(Thermo);高速冷凍離心機(jī)(SORVALL? Biofuge stratos)。

氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)

標(biāo)本的處理及衍生化 測定時，血清經(jīng)37℃解凍15 min，取50 μl血清加甲醇(含內(nèi)標(biāo)甲基肉豆蔻酸 12.5 μg/ml)200 μl，渦旋提取 5 min 后 4℃靜置1h，20 000g離心10 min，取上清100 μl于 GC 小瓶，減壓揮干溶劑。向GC小瓶中加入甲氧胺吡啶溶液(10 mg/ml)30 μl，渦旋 4 min 后肟化反應(yīng) 17h。加MSTFA(含 1%TMCS 作為催化劑)30 μl，渦旋 1 min后三甲硅烷基化反應(yīng)1h。最后加入外標(biāo)甲基硬脂酸庚烷液(30 μg/ml)30 μl，渦旋 4 min 后即可作為待測樣品。尿標(biāo)本，1 600g離心10 min，在 50 μl尿中加入50 IU尿素酶(溶解于50 μl生理鹽水中)，置37℃水浴保溫2h，充分反應(yīng)以去除過量尿素。20 000g離心10 min分離沉淀后取上清液50 μl置于GC小瓶中，同上法處理和分析。

樣品采集 血尿衍生化樣品經(jīng)GC/MS檢測，毛細(xì)管柱 10m × 0.18 mm，0.18 μm DB－5－MS 固定相(J＆W scientific，F(xiàn)olsom，CA);進(jìn)樣口溫度250℃，載氣氦氣流速1.5 ml/min，采用程序升溫模式，柱溫初始值設(shè)定為 80℃，維持 3 min，然后從 80℃ 以20℃/min的速度升溫至300℃，維持2 min。毛細(xì)管柱流出組分進(jìn)入離子源，傳輸管溫度設(shè)為220℃，離子源溫度為200℃。離子化電壓為200 eV，電流9.0 mA。MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，掃描范圍50～700 m/z，采集速度為30 pectra/s。記錄質(zhì)譜的保留時間，NIST譜庫中檢索鑒別這些化合物的結(jié)構(gòu)并用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行確證。

液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)

標(biāo)本處理 血清和尿液經(jīng)37℃解凍20 min。50 μl標(biāo)本中加入甲醇200 μl沉淀蛋白，渦旋1 min后，12 000g 離心 15 min。取上清 200 μl，0.22 μm微孔過濾，加入自動取樣小瓶，待測。

樣品采集 色譜條件:色譜柱為C18柱(2.1×100 mm，1.7 μm)，進(jìn)樣量 5 μl，流速為 500 μl/min;流動相由1%的甲酸水溶液(A)和1%的甲酸乙腈溶液組成;流動相B開始比例為10%，維持3 min;在3～10 min濃度線性升至55%;第10 min升至95%，并維持至第55 min;第65 min降至初始比例10%，平衡3 min。質(zhì)譜條件:掃描模式為總離子流圖(TIC)。氣簾:30Psi，噴霧電壓(IS):4 500V，輔助霧化溫度(TEM):350℃。正離子模式中，椎孔電壓(DP)120V，碰撞能量(CE)30V。負(fù)離子模式中，DP －120V，CE －30V。以500 pg/ul的亮氨酸－腦啡肽為內(nèi)標(biāo)，流速2 μl/min，檢測離子為［M+H］+，m/z為554.261 5 Da，掃描時間15 min。

樣本鑒定 所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)包括保留時間、m/z和離子強(qiáng)度均由儀器中的MetabolitePilotTM軟件建立數(shù)據(jù)矩陣。峰寬度5%，高度1s，閾值120，質(zhì)譜窗0.04 amu，保留時間窗0.15 min?；衔锝?jīng)metlin database(metlin.scripps.edu)中標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜及保留時間來確認(rèn)。

統(tǒng)計學(xué)分析 利用SIMCA－P 11.0軟件對血尿樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，實驗樣本作為觀測變量、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化的峰面積作為響應(yīng)變量建立數(shù)據(jù)矩陣，然后運用主成分分析 (principal component analysis，PCA)和偏最小二乘－判別式分析 (partial least squares discriminant analysis，PLS－DA)進(jìn)行數(shù)據(jù)降維。PLS－DA樣品分布得分圖(score plot)用于展示組間差異。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)表示，計數(shù)資料以百分率表示。多組間計量資料的比較采用 One－Way ANOVA 或 Kruskal－Wallis H 檢驗，兩組間計量資料的比較采用Tukey HSD或Mann－Whitney U檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件，結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

患者臨床特征 如表1所示，三組患者的年齡和DM病程等一般情況未見顯著差異，但蛋白尿組患者，其空腹、餐后血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)及三酰甘油水平均高于單純DM組及微量白蛋白尿組(P＜0.05)。隨腎臟病變進(jìn)展，患者合并高血壓、視網(wǎng)膜病變和大血管并發(fā)癥的比例逐漸升高。治療方面，三組患者均使用了不同種類的口服降糖藥及胰島素治療，微量白蛋白尿組和蛋白尿組血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ACEI/ARB)類藥物使用率高于尿白蛋白正常組。

血清和尿液中檢測到的化合物 GC/MS:血清中共檢出113個峰，其中48個化合物被鑒定;尿液中檢出119個峰，其中59個化合物被鑒定。如圖1A－D、圖2A－D所示，各組間的總離子流圖存在差異。

LC/MS檢出的化合物很多，但僅有少數(shù)得到鑒定，其中血清正離子模式82種，負(fù)離子模式41種，尿液正離子模式65種，負(fù)離子模式50種。

多元數(shù)據(jù)分析結(jié)果 不同組別患者血清及尿液GC/MS檢測的樣品分布得分圖見圖1E－G及圖2E－G。圖中每個點代表一個樣本，每個樣本在圖中的位置由該樣品中小分子組成和濃度所決定，因此，組分相近的樣本，其在得分圖上的位置也比較靠近。不同組別患者，其血清及尿液樣本間呈現(xiàn)不同的分布，但尿白蛋白正常組與微量白蛋白尿組的血清和尿液樣本間存在少量重疊。PLS－DA模型對于樣本的解釋度和預(yù)測度見表2，其中模型對于尿白蛋白正常組和微量白蛋白尿組差異的預(yù)測度和解釋度低于其他組。

代謝產(chǎn)物隨疾病進(jìn)展的變化特點

糖代謝 如表3、4所示，DN患者的糖酵解及三羧酸循環(huán)代謝通路障礙，血清葡萄糖水平隨疾病進(jìn)展持續(xù)升高，而丙酮酸、乳酸及三羧酸(TCA)循環(huán)產(chǎn)物水平在各組間相未見顯著統(tǒng)計學(xué)差異，并且尿液TCA產(chǎn)物如檸檬酸在蛋白尿組出現(xiàn)顯著下降。PKC通路存在異常活化，血清磷脂酰膽堿(PC)隨病情進(jìn)展呈現(xiàn)下降，溶血磷脂酰膽堿(lysoPC)呈現(xiàn)先升后降趨勢，而花生四烯酸水平升高。己糖胺通路也存在異?；罨骞劝滨０芳澳蛞耗蜞奏ざ姿?UDP)水平在微量白蛋白尿組和蛋白尿組顯著下降。多元醇通路不符合活化表現(xiàn)，即血清二?；视?Dg)水平隨病情進(jìn)展出現(xiàn)下降，而山梨醇及果糖水平在各組間未見顯著差異。

表1 三組患者的臨床特征

表2 PLS-DA模型對于樣本的預(yù)測度和解釋度

氨基酸代謝 微量白蛋白尿組和蛋白尿組的血清谷氨酰胺水平顯著低于尿白蛋白正常組;其余氨基酸水平隨疾病進(jìn)展而升高，以支鏈氨基酸明顯，但蛋白尿組較微量白蛋白尿組有所下降(表3);尿液中絕大多數(shù)氨基酸在尿白蛋白正常組及蛋白尿組均低于正常對照，但微量白蛋白尿組與正常對照未見顯著差異。尿液牛磺酸水平隨病情進(jìn)展呈持續(xù)下降狀態(tài)(表4)。

脂代謝 四組的血清必需脂肪酸(亞油酸及亞麻酸)水平未見顯著差異。但三個疾病組的非必需脂肪酸(花生四烯酸、棕櫚酸)及反式脂肪酸(反油酸)水平較正常對照組顯著升高，其中，微量白蛋白尿和蛋白尿組的棕櫚酸水平較尿白蛋白正常組升高并有統(tǒng)計學(xué)差異。另外，DN患者的脂肪酸分解代謝存在障礙，與脂肪酸β氧化密切相關(guān)的左旋肉堿和脂酰輔酶A水平在微量白蛋白尿和蛋白尿組較前兩組出現(xiàn)下降(表3)。尿液中部分游離脂肪酸(花生二烯酸、十八烷二酸)水平隨疾病進(jìn)展持續(xù)升高(表4)。

表3 各組間差異顯著的血清代謝產(chǎn)物

表4 各組間差異顯著的尿液代謝產(chǎn)物

候選的生物標(biāo)志物 早期診斷的候選標(biāo)志物:血清中棕櫚酸水平在尿白蛋白正常組與對照組無顯著差異，而微量白蛋白尿組和蛋白尿組出現(xiàn)顯著升高，提示可能作為疾病早期診斷的候選血清標(biāo)志物;而尿液中的 PC(P－19∶1(12Z)/0∶1)和十八烷二酸隨病情進(jìn)展持續(xù)升高，且在微量白蛋白尿組和蛋白尿組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，也可能作為疾病早期診斷的候選尿液標(biāo)志物。

病情進(jìn)展的候選標(biāo)志物:血清左旋肉堿、PC(9∶0/0∶0)和 Dg(17∶2(9Z，12Z)/20∶3(8Z，11Z，14Z)/0∶0)，尿液UDP水平在微量白蛋白尿組出現(xiàn)顯著下降，而蛋白尿組降低更明顯;尿液 lysoPC(16∶0)在微量白蛋白尿組出現(xiàn)升高，而蛋白尿組升高更明顯，提示這些化合物可以作為判斷病情嚴(yán)重程度的候選標(biāo)志物。

討 論

Mogensen根據(jù)DN的病理生理特點和病程將DN分為5期，即腎小球高濾過和腎臟肥大期、正常白蛋白尿期、持續(xù)微量白蛋白尿期、臨床DN期和終末期腎功能衰竭期［9］。目前臨床上診斷DN主要依據(jù)微量白蛋白尿，而Ⅰ期和Ⅱ期患者并無較好的診斷標(biāo)志，難以及時診斷及干預(yù)。

DN的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，其疾病基礎(chǔ)是糖代謝紊亂，在特定遺傳背景和環(huán)境因素作用下，通過血流動力學(xué)異常、胰島素抵抗(IR)和炎性介質(zhì)活化等機(jī)制引起腎臟損傷。糖代謝紊亂作為DN發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已得到廣泛研究。目前已有研究應(yīng)用代謝組學(xué)方法觀察T2DM患者糖代謝產(chǎn)物水平的變化［5］。但關(guān)于DN患者體內(nèi)代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的研究較少，并且由于疾病分期不明確，很多代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律在不同研究中并不一致［7，8］。綜上，本研究通過代謝組學(xué)的方法觀察不同時期DN患者血清和尿液糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝相關(guān)產(chǎn)物的變化規(guī)律，并用于發(fā)現(xiàn)疾病早期診斷及進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，各組患者的血清及尿液代謝產(chǎn)物水平呈現(xiàn)完全不同的分布。其中，尿白蛋白正常組可能包括單純DM以及Mogensen分期中Ⅰ期和Ⅱ期DN患者，其與微量白蛋白尿期和臨床DN期三組患者之間在臨床指標(biāo)和代謝水平上均存在顯著差異，提示隨著病情進(jìn)展，DN患者的代謝水平持續(xù)異常且不同時期的代謝特點不盡一致?？蓳?jù)此發(fā)現(xiàn)疾病早期診斷和進(jìn)展的候選標(biāo)志物。同時，我們也觀察到PLS－DA模型中尿白蛋白正常組與微量白蛋白尿組的血清和尿液樣本間存在少量重疊，且該模型對于尿白蛋白正常組和微量白蛋白尿組差異的解釋度和預(yù)測度均較其余組低，這也進(jìn)一步證實了尿白蛋白正常組并非一個均一整體，部分尿白蛋白正常患者與微量白蛋白尿患者代謝水平差異不大，可能已存在腎臟損傷。因此，微量白蛋白尿作為DN早期診斷指標(biāo)其敏感性較低。

正常情況下，葡萄糖主要通過糖酵解和TCA循環(huán)分解供能。T2DM患者由于存在IR，葡萄糖的分解代謝存在障礙。本研究也表明DN患者存在多種糖代謝通路紊亂。三組患者中，隨著病情加重，血清和尿液葡萄糖水平持續(xù)升高，而丙酮酸、乳酸及TCA循環(huán)產(chǎn)物在四組間未見顯著差異，且尿液三羧酸循環(huán)產(chǎn)物在蛋白尿組出現(xiàn)顯著下降，提示隨著DN進(jìn)展，糖酵解及TCA循環(huán)通路障礙逐漸加重。

既往研究證實，DM患者體內(nèi)有4條異?；罨奶谴x通路與腎臟損傷有關(guān)，即多元醇通路、AGEs形成、PKC通路和己糖胺通路［10］。其中，PKC通路活化引起PLA2活性升高，PLA2能夠特異性催化甘油磷脂C－2位置酯鍵水解產(chǎn)生花生四烯酸［11］。本研究很好的驗證了PKC通路的活化，在尿白蛋白正常期和微量白蛋白尿期，由于PLA2活性增高，催化PC類磷脂C－2酯鍵水解產(chǎn)生lysoPC，從而引起PC下降及l(fā)ysoPC升高。而到蛋白尿期，PC水平下降，lysoPC產(chǎn)生也隨之下降，從而出現(xiàn)PC與lysoPC水平的一致下降。同時，整個病程中花生四烯酸水平出現(xiàn)顯著升高，也符合PKC通路活化的改變。PKC通路活化可使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，并抑制一氧化氮活性促使局部缺氧和血管通透性增加，從而引起腎臟損傷［12］。另外，己糖胺通路活化可使葡萄糖生成尿嘧啶二磷酸－N－乙酰－葡萄糖胺(UDPGlcNAc)，這個過程中消耗谷氨酰胺和UDP。本研究發(fā)現(xiàn)血清谷氨酰胺和尿液UDP在微量白蛋白尿組和蛋白尿組出現(xiàn)顯著下降，符合己糖胺通路活化的表現(xiàn)［13］。己糖胺通路激活可增加轉(zhuǎn)化生長因子(TGF－β)和炎性介質(zhì)釋放，參與 DN 發(fā)生［13］。在多元醇通路中，醛糖還原酶的激活使葡萄糖大量轉(zhuǎn)化為山梨醇，繼而氧化果糖形成NADH，使Dg合成增加［14］。本研究未能證實多元醇通路的活化，Dg水平隨病情進(jìn)展出現(xiàn)下降，而山梨醇及果糖水平在各組間未見顯著差異，與以往研究中多元醇通路活化的表現(xiàn)并不一致。

氨基酸水平的變化也可反映DN患者的腎臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)微量白蛋白尿組和蛋白尿組的血清谷氨酰胺水平顯著降低。谷氨酰胺是人體含量最豐富的氨基酸，作為糖代謝和氨基酸代謝的重要中間體，谷氨酰胺能夠改善IR［15］，并減輕膿毒癥引起的急性腎小管損傷［16］。因此，其水平的下降除了提示己糖胺通路活化外，也有可能參與了DN患者的腎臟損傷。氨基酸代謝的另一個突出表現(xiàn)是血清支鏈氨基酸水平的改變。本研究中三個疾病組的支鏈氨基酸水平均高于正常對照，而蛋白尿組較微量白蛋白尿組有所下降。已有研究證實血清支鏈氨基酸水平的升高能預(yù)測IR及DM的發(fā)生［17］。而慢性腎臟病晚期患者，因代謝性酸中毒導(dǎo)致支鏈氨基酸分解，其水平下降［18］。本研究中支鏈氨基酸水平的變化與DN患者的病理生理特點呈現(xiàn)了較好的一致性。另外，我們也觀察到尿液?；撬崴诫S病情進(jìn)展持續(xù)降低。牛磺酸能夠抑制腎臟局部脂質(zhì)過氧化、AGEs形成并減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管損傷，且DN患者血清?；撬崴绞墙档偷模?9］。因此尿液?；撬崴降南陆悼赡茉贒N腎小管損傷中起著重要作用。

正常情況下，脂肪酸主要通過β氧化進(jìn)行分解代謝，這個過程必須依賴左旋肉堿，并生成脂酰輔酶A。本研究發(fā)現(xiàn)微量白蛋白尿組和蛋白尿組DN患者的血清左旋肉堿和脂酰輔酶A的水平較正常對照組和尿白蛋白正常組顯著下降，而非必需脂肪酸水平持續(xù)升高，以棕櫚酸水平升高尤為顯著，符合脂肪酸β氧化障礙的表現(xiàn)。脂代謝紊亂在DN發(fā)生中起著重要作用，高脂血癥不僅參與IR和心血管并發(fā)癥的發(fā)生，還可作用于系膜細(xì)胞和足細(xì)胞加重蛋白尿和腎間質(zhì)纖維化。體外實驗證實，棕櫚酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡［20］，而尿液游離脂肪酸水平升高可以引起DN患者腎小管間質(zhì)的損傷［21］。因此，游離脂肪酸水平與DN患者腎損傷存在密切聯(lián)系。另外，本研究三個疾病組的血清反式脂肪酸水平出現(xiàn)顯著升高。反式脂肪酸水平的升高與腎臟損傷的關(guān)系目前尚不明確，但其可增加心血管疾病的風(fēng)險［22］。并且我們以往的工作證實，T2DM患者心臟損害與腎損害密切相關(guān)［23］。反式脂肪酸是否會引起腎損傷尚需進(jìn)一步研究證實。

本研究還發(fā)現(xiàn)一些候選的病情診斷標(biāo)志物，如與疾病早期診斷相關(guān)的候選標(biāo)志物有血清棕櫚酸、尿 PC(P－19∶1(12Z)/0∶1)和十八烷二酸;而預(yù)測疾病進(jìn)展的候選標(biāo)志物有血清左旋肉堿、PC(9∶0/0∶0)和 Dg(17∶2(9Z，12Z)/20∶3(8Z，11Z，14Z)/0∶0)，尿液UDP和lysoPC(16∶0)。這些物質(zhì)大多為糖代謝和脂代謝中間產(chǎn)物，其水平變化不僅提示IR狀態(tài)下糖脂代謝通路改變，也與腎臟損傷密切相關(guān)。目前也有研究觀察尿白蛋白陰性但GFR下降的T2DM患者，發(fā)現(xiàn)辛醇、草酸、磷酸等11個化合物可預(yù)測GFR水平［7］。而T1DM患者?；鈮A、甘氨酸和色氨酸代謝產(chǎn)物與微量白蛋白尿產(chǎn)生有關(guān)［24］。本研究發(fā)現(xiàn)的候選標(biāo)志物與既往研究并不完全一致，尚需后續(xù)大樣本研究驗證其敏感性和特異性。

綜上所述，本研究應(yīng)用代謝組學(xué)方法較好的展示了不同時期DN患者糖、氨基酸和脂代謝產(chǎn)物的變化特點，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)疾病早期診斷及病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。證實代謝組學(xué)可作為研究DN患者宏觀代謝水平和微觀病理生理機(jī)制的較好的研究方法。

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