張 彬，汪 波，龔 元，于 翔，呂軍儀

(1.廣西水產(chǎn)研究所廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021；2.北京師范大學(xué)珠海分校，廣東 珠海519085；3.荊州市民康生物科技有限公司，湖北 荊州 434300；4.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000；5.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

中藥水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具逐惡血瘀血月閉，破血瘕積聚的功效[1]，臨床上可用于腦血管疾病、精液不化、前列腺肥大、子宮卒中綜合征等多種疾病的治療[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，水蛭及水蛭提取液具有抗凝血、抗血栓形成的作用，并且不同提取方法具有不同的作用及強度，其活性成份是以水蛭素為主要代表的肽類化合物[3-5]，其中水蛭素(Hirudin)是迄今世界上發(fā)現(xiàn)最強的天然凝血酶抑制劑[6]。不同種類的水蛭含有特定的活血有效成分[7]。分離純化和活性檢測工作是開發(fā)利用水蛭素等活性物質(zhì)的基礎(chǔ)[8]。水蛭素類物質(zhì)分離提取方法報道較多[9-11]，提取效率的高低是關(guān)鍵。對于水蛭抗凝血酶活性檢測，主要集中在對不同物種及其部位抗凝血活性比較[12-14]。由于野生水蛭資源減少，人工養(yǎng)殖水蛭逐漸興起[15]。而針對野生和養(yǎng)殖條件下水蛭活體、干體粉末及唾液腺分泌物抗凝成分提取方法和活性檢測的研究目前未見報道。本研究以菲牛蛭提取液的抗凝血酶活性為指標(biāo)，比較不同提取方法對水蛭抗凝血活性物質(zhì)的浸提效果，并利用篩選的最佳提取方法對不同物種、地理分布、飼養(yǎng)條件和處理的水蛭樣品進行比較分析，以期為中藥水蛭的合理開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生寬體金線蛭Whitmaniapigra和光潤金線蛭Whitmaniaacranulata活體于2006年采自江蘇省宿遷市，野生尖細(xì)金線蛭Whitmanialaevis活體于2006年采自山東魚臺，野生日本醫(yī)蛭活體Hirudonipponia于2007采自湖北省公安縣，野生菲牛蛭Hirudinariamanillensis活體于2006年分別采自廣東清遠(yuǎn)，廣西南寧和海南瓊中；不同營養(yǎng)餌料飼養(yǎng)的菲牛蛭活體由荊州市民康生物科技有限公司提供。本實驗于2007年在中山大學(xué)水生經(jīng)濟動物研究所完成。

1.2 試劑

纖維蛋白原(上海生物制品研究所生產(chǎn))，凝血酶(天津生物化學(xué)制品廠生產(chǎn))，氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉和乙醇等均為分析純。

1.3 實驗設(shè)備

TGL—16GB型高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，恒溫水浴鍋(山西省文水醫(yī)療器械廠)，萬能粉碎機(XA-I型，江蘇姜堰市分析儀器廠生產(chǎn))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABOROTA，4001-efficient Heidolph)和抽真空冷凍干燥器(CHRIST ALPHA 1-4)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 水蛭樣品處理

水蛭干體粉末制備：自然風(fēng)干后(平均氣溫低于20 ℃)，用粉碎機制備成粉末，將粗粉樣品過三號篩而得到的為細(xì)粉樣品[16]。水蛭唾液腺分泌液采用特殊誘吐技術(shù)從活體吸血水蛭體內(nèi)提取，置-75 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。水蛭濕體勻漿液樣品通過組織勻漿機搗碎獲得。

1.4.2 水蛭抗凝活性物提取方法

藥液I(鹽浸提法M1) 稱取50 g水蛭樣品(濕體勻漿液、干體粉末和唾液腺分泌液)，用4倍體積生理鹽水(w=0.9％NaCl)充分浸泡溶解30 min，其間不斷攪拌；用φ=10％的三氯乙酸溶液調(diào)pH值至2.5，然后置于水浴鍋內(nèi)70 ℃水浴30 min，其間適當(dāng)攪拌；4 ℃下，10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清液；用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0；4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清液；所得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀90 r/min，30 ℃下減壓抽真空濃縮至1/5體積，所得藥液備用[10,17]。

藥液II (丙酮浸提法M2) 稱取50 g水蛭樣品(濕體勻漿液、干體粉末和唾液腺分泌液)，加入4倍體積冰箱(-10 ℃)中預(yù)冷的φ=85％丙酮液，攪拌后置于-20 ℃冰箱內(nèi)充分溶解過夜；小心地吸出上層的丙酮液，4 ℃下，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集沉淀；加入冰箱(-10 ℃)中預(yù)冷的φ=10％三氯乙酸溶液(20 mL)，使其充分溶解；4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清液用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0后備用[18]。

藥液III(醇浸提法M3) 稱取50 g水蛭樣品(濕體勻漿液、干體粉末和唾液腺分泌液)，加入3倍體積的0.5 M NaCl溶液，室溫下，充分?jǐn)嚢枞芙?0 min；用3 N鹽酸酸化至pH2.0，然后于水浴鍋內(nèi)70 ℃水浴15 min，其間適當(dāng)攪拌；4 ℃下，10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清液；向上清液中加入1.5倍體積的無水乙醇，再次離心棄沉淀；上清液在40 ℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，抽真空濃縮至原體積的1/5；加入等體積的丙酮液，離心去除形成的沉淀；上清液中，加入4倍體積的冷丙酮液(-10 ℃)，有沉淀析出；收集沉淀，抽真空冷凍干燥后，固體粉末即為得到的粗品；用0.5 M NaCl溶液(80 mL)溶解凍干粉后備用[19-20]。

1.4.3 凝血酶滴定法

所用主要試劑：0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，0.5 mol/L HCl和w=0.5％的纖維蛋白原溶液；用0.5 mL生理鹽水，輕搖溶解凝血酶，根據(jù)所購的凝血酶活性單位，依次配制成500、250、125、62.5、31.25和7.8125 NIH/mL系列濃度梯度，w=0.5％的纖維蛋白原溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。具體測定方法：加200 μL血纖維蛋白溶液入2.5 mL圓底玻璃小試管(帶試管夾)中，加待測提取樣品液100 μL，加凝血酶溶液5 μL，略振，混勻，馬上置37 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)1 min，取出，觀察玻璃試管內(nèi)溶液是否膠凍化，若否，則每隔1 min滴定凝血酶一次，直至出現(xiàn)膠凍為止，記錄加入的凝血酶量。此過程加的凝血酶濃度從高到低(500、250、125、…)逐步縮小凝血酶的活性范圍。精確測量：根據(jù)測定結(jié)果，以獲得最小滴定次數(shù)為目標(biāo)確定滴加的凝血酶濃度的組合，重復(fù)測定3次。如果樣品濃度過高，可用生理鹽水稀釋5～10倍后，再取樣測活?？鼓钚孕r計算：100 μL待測水蛭提取液活性=∑凝血酶濃度×滴加量，并由此折算單位質(zhì)量或體積的抗凝血酶活性[21-22]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)由平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± S.D.)表示，采用單因子方差分析(One-Way ANOVA)。如果差異顯著(P<0.05)，再進一步以Duncan’s法進行多重比較。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5(Statistical Program for Social Sciences.11.5)統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同提取方法對養(yǎng)殖菲牛蛭抗凝血酶活性的影響

由表1可知，不同提取方法對養(yǎng)殖菲牛蛭各處理品抗凝血酶活性物質(zhì)提取效率依次為丙酮浸提法、鹽浸提法和醇浸提法，且濕體勻漿液、干體粉末和其唾液腺分泌液在3種不同提取方法下均表現(xiàn)出一致的抗凝活性規(guī)律；其中丙酮浸提法在菲牛蛭各個處理樣品中均具有最高的提取得率，在鹽浸提法和醇浸提法下所測抗凝活性均顯著低于丙酮浸提法(P<0.05)。

表1 不同提取方法下養(yǎng)殖菲牛蛭抗凝血酶活性效價比較1)

2.2 不同野生水蛭抗凝血酶活性比較

不同水蛭抗凝血酶活性檢測結(jié)果見表2。寬體金線蛭和光潤金線蛭2種非吸血蛭類的濕體勻漿液和干體均無抗凝活性，且非吸血的尖細(xì)金線蛭也顯示很低的抗凝活性；同時檢測出日本醫(yī)蛭和菲牛蛭2種吸血蛭類具有較高抗凝活性，且菲牛蛭的抗凝活性顯著高于日本醫(yī)蛭(P<0.01)，可見吸血蛭類不同種類間抗凝活性也存在一定差異。此外，日本醫(yī)蛭和菲牛蛭的活體與干體之間活性效價也有較大差異，即從活體到干體，其活性大大損失，損失率超高50％。

表2 5種不同食性野生水蛭抗凝血酶活性效價比較1)

2.3 野生和養(yǎng)殖菲牛蛭抗凝血酶活性比較

由表3可見，3種不同地理分布的野生菲牛蛭(廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭和海南菲牛蛭)和2種不同餌料飼養(yǎng)的菲牛蛭(天然動物血液和人工飼料喂養(yǎng))，其濕體勻漿液、干體粉末和唾液腺分泌液的提取液抗凝活性均無顯著差異(P>0.05)，其中3種野生菲牛蛭濕體勻漿液和干體粉末的抗凝活性要略高于2種飼養(yǎng)菲牛蛭(P>0.05)，而唾液腺分泌液的抗凝活性則無顯著差異，且不同餌料飼養(yǎng)的菲牛蛭各處理品間抗凝活性亦無差異(P>0.05)。

表3 野生和養(yǎng)殖菲牛蛭抗凝血酶活性效價比較1)

3 討 論

不同提取方法對菲牛蛭抗凝血酶活性比較實驗結(jié)果表明：3種不同浸提藥液抗凝作用差異明顯，其中丙酮浸提法具有最佳的抗凝活性，證明其提取得率最高；而鹽浸提法和醇浸提法的抗凝活性均明顯低于丙酮浸提法。分析原因一方面推測是有機溶劑的萃取作用優(yōu)于鹽溶液，但更可能是鹽浸提法和醇浸提法中存在的高溫處理對活性物質(zhì)產(chǎn)生了不利影響，由于溫度升高使部分蛋白質(zhì)變性失活所致[10]，而丙酮浸提法方法一直在低溫下操作，所以獲得最高的抗凝物質(zhì)得率，這與覃樹先[12]的研究結(jié)論一致。因此，篩選有效的提取方法能夠高效利用水蛭類中藥資源。

5種水蛭抗凝血酶活性效價比較實驗結(jié)果表明，抗凝血物質(zhì)的有無或強弱與水蛭食性有著直接關(guān)系[23]，即吸血類的菲牛蛭和日本醫(yī)蛭具有較強的抗凝活性，其中菲牛蛭的抗凝活性又高于日本醫(yī)蛭，而依靠吸吮螺體、蚌殼等軟體動物體液生存的3種非吸血類水蛭中，除尖細(xì)金線蛭具有弱的抗凝血酶活性外，寬體金線蛭和光潤金線蛭均無抗凝活性，其體內(nèi)可能不含水蛭素類的抗凝血酶活性物質(zhì)，這與張漢貞等和歐興長等的研究結(jié)論相一致[23-24]。吸血類的菲牛蛭和日本醫(yī)蛭，其活體和干體的抗凝血酶活性均表現(xiàn)出較大差異，本實驗結(jié)果表明上述兩種水蛭在從活體到干體的處理過程中，其抗凝活性損失率均超過50％，這與汪文茉等[14]的研究結(jié)果一致。本實驗中所測得日本醫(yī)蛭活體和干體抗凝活性分別為161.2和361.9 AT-U/g，而張漢貞等[23]所測日本醫(yī)蛭活體和干體抗凝活性分別為82.2和159.2 AT-U/g，兩者差距較大，分析原因可能是由于所采用的浸提方法不同而致，前者采用丙酮浸提法，而后者采用生理鹽水提取法。實驗結(jié)果證明3種非吸血水蛭(寬體金線蛭、光潤金線蛭和尖細(xì)金線蛭)的抗凝活性較弱或無，但不能由此推斷其藥理活性不強或無，因為本研究測定的僅是抗凝血酶活性，不能代表其全部藥理活性，非吸血類水蛭的藥用成分與其療效的關(guān)系有待進一步深入研究[24]。

在實驗中，我們根據(jù)吸血類水蛭的取食行為自行設(shè)計了一套從活體菲牛蛭和日本醫(yī)蛭唾液腺中提取新鮮唾液腺分泌液的方法[18]，對菲牛蛭和日本醫(yī)蛭唾液腺分泌物的抗凝測定結(jié)果顯示菲牛蛭的平均抗凝血酶活性均超過45 AT-U/mL，日本醫(yī)蛭的抗凝活性為38.5 AT-U/mL，菲牛蛭的活性略高于日本醫(yī)蛭，均具有較強的抗凝活性，并且一條水蛭可以反復(fù)提取數(shù)次，而不損傷或殺死蛭體，可有效提高對日益減少野生水蛭資源的利用率。

研究表明菲牛蛭具有較強的體外抗凝血酶活性，實驗結(jié)果顯示野生和養(yǎng)殖菲牛蛭的濕體勻漿液、干體粉末和唾液腺分泌液抗凝活性均無顯著差異，并且不同餌料飼養(yǎng)的菲牛蛭抗凝活性也無明顯差異，證明人工養(yǎng)殖對菲牛蛭的抗凝活性未產(chǎn)生不利影響。因此，開展菲牛蛭規(guī)模化人工養(yǎng)殖能夠保證藥源本身的安全和藥效穩(wěn)定性，是解決菲牛蛭野生資源日漸匱乏和滿足日益增長市場需求的唯一途徑。

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