趙 陽，梁麗珍，李厚金，文詩雅，藍(lán)文健,3

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州510275；3.廣東省現(xiàn)代中藥工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 廣州510006)

威靈仙(ClematischinensisOsbeck)，屬毛茛科植物。在臨床治療上，它用于治療痛風(fēng)頑痹、肢體麻木、筋脈拘攣，減弱風(fēng)濕痹痛、諸骨鯁咽，減少水腫、降血壓和治療外傷等。

有關(guān)威靈仙的化學(xué)成分，近年來陸續(xù)有一些報道，但研究主要集中于威靈仙的大極性組分，如：1992年Song Chunqing等分離到由D-葡萄糖和4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸組成的大環(huán)糖苷clemochinenoside[1]。此外，從威靈仙的根部提取物中分離得到一系列三萜甙[2-6]。威靈仙中所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)皂苷的苷元均為齊墩果酸，其總皂苷具有抗腫瘤及抗炎鎮(zhèn)痛的作用。

我們對威靈仙根莖乙酸乙酯提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，分離鑒定了7個化合物：松脂素(Pinoresinol，1)，Epipinoresinol(2)，羅漢松脂素(Matairesinol，3)，Salicifoliol(4)，3,4,5-三羥基苯甲酸(5)，4-羥基-3,5-二甲氧基-苯甲酸(6)，異阿魏酸(7)，化合物結(jié)構(gòu)通過NMR和MS的分析得到確定。化合物1,2,3,4是木脂素類化合物，它們是首次從威靈仙中發(fā)現(xiàn)，具有多種重要的生理活性，其潛在藥用前景明顯。

1 實驗部分

1.1 藥材、試劑與儀器

威靈仙干燥根莖，由廣東羅浮山國藥股份有限公司提供。

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，市售分析純；乙腈，HPLC級，購于Sigma公司。

美國Varian公司INOVA 500NB，Bruker公司AVANCE AV 400 MHz核磁共振儀。Thermo DSQ EI低分辨質(zhì)譜儀，Thermo MAT95XP EI高分辨質(zhì)譜儀。美國Finnigan公司TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。島津LC-20AT高效液相色譜儀，Shim-pack PRC-ODS (250 mm × 20 mm)制備型液相色譜柱，Inertsil?ODS-SP (5μm,4.6 mm × 250 mm) 分析型液相色譜柱。

1.2 化合物的提取與分離

取威靈仙干燥根莖500 g，碾碎。用1 Lw=50%的乙醇回流1 h，提取3次，合并提取液。低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，殘余水層用500 mL乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯提取液，低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干得32.2 g樣品。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯3∶1 (V/V)至石油醚-乙酸乙酯1∶2 (V/V)的組分，該收集組分經(jīng)反相C18制備型高效液相色譜分離，以乙腈-水70∶30 (V/V)為流動相，分離、純化得到化合物1、2、3、4、5、6、7，分別為416、271、46、39、42、55、121 mg。

1.3 高效液相色譜分析實驗條件

樣品溶于乙腈，進(jìn)樣量5 μL。以乙腈-水為溶劑，采用梯度洗脫方法。即：0～10 min，φ=30%的乙腈，然后線性梯度增加乙腈含量，至40 min乙腈的體積分?jǐn)?shù)達(dá)100%，繼續(xù)恒流至65 min。紫外檢測波長為254 nm。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析實驗條件

DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。程序升溫：初始溫度80 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至180 ℃，保持4 min ,再以8 ℃/min升到200 ℃，保持4 min,以10 ℃/min升溫至270 ℃，保持30 min。載氣為氮氣，流速為1 mL/min，分流比為30∶1，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，70 eV，離子源、連接口溫度均為230 ℃。掃描質(zhì)量范圍為50～650 amu,全掃描方式。

1.5 化合物波譜數(shù)據(jù)

化合物1,2,3,4的1H和13C的數(shù)據(jù)見表 1。

化合物1和2， LR EI MSm/z358,343,327,312,259,234,221,205,189,180,163,151,137,131,124,117,103,91,81,65,55。

化合物3，LR EI MSm/z358,234,221,208,194,175,164,137,131,122,94。

化合物4，LR EI MSm/z250，235，233，219，207，198，191，175，165，151，137，123。

化合物5，13C NMR (CDCl3,100 MHz)δC: 170.1 (C)，147.0 (2×C)，138.5 (C)，122.7 (C)，109.6 (2×CH)。1H NMR (CDCl3,400 MHz)δH: 7.06 (s,2H)，6.62 (brs,3H)。

化合物6，HREIMS:m/z198.0522 (C9H10O5,理論值198.052 3)。LREIMS：m/z198,183,168,149,137,109,97,93,81,65。13C NMR (CDCl3,100 MHz)δC: 171.1 (C)，146.6 (2×C)，139.9 (C)，120.0 (C)，107.2 (2×CH)，56.5 (CH3)。1H NMR (CDCl3,400 MHz)δH: 7.40 (s,2H),6.05 (brs,1H),3.97 (s,6H)。

化合物7，13C NMR (DMSO-d6,100 MHz)δC: 167.6 (C)，149.7 (C)，146.4 (C)，144.2 (CH)，126.9 (C)，121.1 (CH)，116.0 (CH)，113.8 (CH)，111.9 (CH)，55.7 (CH3)。1H NMR (DMSO-d6,400 MHz)δH: 9.27 (brs,1H),7.43 (d,J=15.9 Hz,1H),7.062 (dd,J=8.4,1.8 Hz,1H),7.060 (dd,J=1.8 Hz,1H),6.92 (d,J=8.4 Hz,1H),6.91 (brs,1H),6.23 (d,J=15.9 Hz,1H),3.79 (s,3H)。

2 結(jié)果與討論

威靈仙根莖的乙酸乙酯提取物經(jīng)HPLC分析，以254 nm為檢測波長，分析結(jié)果見圖2。由圖可知該提取物中含有大量的分子中具有共軛體系結(jié)構(gòu)的化合物。經(jīng)硅膠柱層析和制備HPLC分離純化得到化合物1,2,3,4,5,6,7，它們在HPLC分析中的保留時間分別為26.51，28.66，29.79，14.62，6.53，7.71，10.16 min。

化合物1，EI MS顯示相對分子質(zhì)量為358。13C NMR顯示10個共振信號，其中3個季碳C，5個CH，1個CH2，1個CH3，提示分子結(jié)構(gòu)對稱，分子式為C20H22O6。3個季碳(δC132.5，145.0，146.5)，3個CH [δC108.6 (δH6.90,d,1.5)，114.2 (δH6.87,d,8.1)，118.7 (δH6.81,dd,8.1,1.5)]構(gòu)成一個1,3,4-三取代苯環(huán)。CH3O-[δC55.8 (δH3.85,s)]與苯環(huán)相連。連氧的CH [δC85.7 (δH4.76,d,4.5)]與苯環(huán)和另外1個CH [δC53.9 (δH3.12,m)]相連，而后者又與另一連氧的CH2[δC71.5 (δH4.26,dd,9.0,6.9;δH3.89,dd,9.0,3.6)]相連。δH6.06 (brs) 為苯環(huán)上的羥基信號。根據(jù)HMBC的相關(guān)關(guān)系，確定其結(jié)構(gòu)為松脂素(Pinoresinol，又名4,4'-[(1S,3aR,4S,6aR)- tetrahydro -1H,3H- furo[3,4-c]furan-1,4-diyl] bis [2-methoxy- phenol])[7]。

化合物2，EI MS顯示相對分子質(zhì)量也為358。13C NMR顯示20個共振信號，其中6個季碳C，10個CH，2個CH2，2個CH3，分子式為C20H22O6。對1H、13C、HMQC、以及HMBC的綜合分析，確定化合物2和1具有完全一致的官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)片段的連接順序，它們僅僅是構(gòu)型上存在差異。化合物2確定為Epipinoresinol，又名4,4'- [(1R,3aR,4S,6aR)-tetrahydro-1H,3H -furo [3,4-c] furan -1,4 -diyl] bis[2-methoxy- phenol][8]。

化合物3，EI MS顯示相對分子質(zhì)量也為358，分子式為C20H22O6。與化合物1和2一樣，分子中含有2個3-甲氧基- 4-羥基取代苯結(jié)構(gòu)單元。剩余6個碳包括1個羰基，2個CH，3個CH2，其中1個CH連氧。根據(jù)氫譜裂分、偶合常數(shù)、以及HMBC的相關(guān)關(guān)系分析，確定3個CH2均和CH相連，而-OCH2-和羰基共同構(gòu)成一個五元內(nèi)酯環(huán)，另外2個CH2則分別和苯環(huán)相連。由此，確定化合物3的結(jié)構(gòu)為羅漢松脂素(Matairesinol)[7]。

圖2 威靈仙乙酸乙酯提取物和化合物1,2,3,4,5,6,7的高效液相分析圖

表1 化合物1,2,3,4的核磁共振數(shù)據(jù)

化合物4，EI MS顯示相對分子質(zhì)量為250，分子式為C13H14O5，其中4個季碳C，6個CH，2個CH2，1個CH3。分子中含有1個3-甲氧基- 4- 羥基取代苯結(jié)構(gòu)單元，剩余6個碳包括1個羰基，3個CH，2個CH2。2個CH2(δC69.8和67.0)和1個CH(δC86.1)連氧，根據(jù)氫譜裂分、偶合常數(shù)可以確定CH2均與CH相連，而羰基(δC178.2)根據(jù)化學(xué)位移可以確定其為內(nèi)酯。由HMQC、HMBC的相關(guān)關(guān)系分析，確定化合物4的結(jié)構(gòu)為Salicifoliol[9]。

化合物5,6,7的結(jié)構(gòu)根據(jù)其1H、13C NMR，以及MS數(shù)據(jù)分別確定為3,4,5-三羥基苯甲酸，4-羥基-3,5-二甲氧基-苯甲酸，異阿魏酸。

乙酸乙酯提取物樣品用乙腈溶解，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜實驗。氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖(圖3)顯示化合物1，2，3，4的保留時間分別為86.86，85.64，80.79，62.79 min，按峰面積歸一化法計算各個化合物的百分含量分別為2.39，1.46，0.56，0.58?；衔?，2，3，4的氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜圖(圖4)與其純化合物的LREIMS圖基本一致。

圖3 威靈仙乙酸乙酯提取物的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)威靈仙中富含結(jié)構(gòu)多樣性的木脂素類化合物，建立了木脂素的HPLC和GC-MS色譜分析方法，該方法具有快速、穩(wěn)定和精確的特點。木脂素是由苯丙素單元聚合而成，它具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗蟲、抗氧化、保肝、抑制植物生長等[10-12]。因此，以威靈仙為藥用原材料，研究與開發(fā)創(chuàng)新藥物，前景廣闊。而以木脂素類化合物的組成和含量分析也將可作為威靈仙藥材質(zhì)量檢測和所制成的中成藥質(zhì)量控制的方法。

圖4 化合物1,2,3,4的質(zhì)譜圖

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