李 冰，董征英，常維山

（山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

黃曲霉毒素（AF）是由黃曲霉、寄生曲霉等幾種真菌產生的次生代謝產物，是一類結構和理化性質相似的分子真菌毒素，是一種毒物和強致癌物質，AFB1是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種[1-2]。黃曲霉毒素存在廣泛、危害巨大，畜禽食入被污染的飼料會降低動物的生產性能、引發(fā)一系列疾病，可間接通過食物鏈進入人體并具有極強的致癌作用，嚴重威脅人類健康[3]。

目前在糧食和飼料的貯藏過程中不可避免產生霉菌毒素，解決霉毒素尤其是AFB1對糧食和飼料的污染是一個世界性難題。傳統(tǒng)去除AFB1的方法主要有吸附、萃取、熱處理、射線處理、酸堿處理、氧化還原處理，但是有費時費力、去毒率不高、易造成營養(yǎng)物質流失的缺點。目前發(fā)現(xiàn)自然界中有多種微生物能吸附或降解飼料或食品中的黃曲霉毒素，這些微生物包括細菌、酵母菌′、霉菌、放線菌和藻類等。采用微生物或其產生酶進行脫毒不僅條件相對溫和，不會破壞產品的品質，而且有些還能增加產品的營養(yǎng)價值[4]。其中黑曲霉在降解AFB1方面不僅表現(xiàn)出了高效、經濟、安全等優(yōu)點，還會抑制飼料中黃曲霉的生長和提高飼料利用率的優(yōu)勢。因此，研究開發(fā)利用黑曲霉來進行AFB1的生物脫毒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

黑曲霉購自中國微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1。

1.3 試驗試劑與設備

AFB1標準品（以色列Fermentek公司生產）用乙腈配制成1 mg·mL-1備用。試驗設備包括高效液相色譜儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、冷凍離心機等。

2 試驗方法

2.1 黑曲霉對AFB1的降解作用

將黑曲霉接入50 mL PDB培養(yǎng)基中，于37℃、150 rpm，搖床培養(yǎng)2 d，然后加入1 mg·mL-1AFB15μL，3 d后檢測AFB1含量；用只含AFB1的PDB培養(yǎng)基作為對照組。

2.2 降解曲線的測定

將黑曲霉和1 mg·mL-1AFB15μL接入100 mL PDB培養(yǎng)基中。每隔3 h測定1次毒素降解率，連續(xù)測定15 h。

2.3 黑曲霉降解AFB1活性組分的確定

將黑曲霉接入100 mL PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液50 mL，在4℃、8 000 rpm條件下冷凍離心20 min，分離上清液與菌體細胞，取上清液，即得胞外粗提液；將沉淀的菌體細胞用蒸餾水連續(xù)洗滌兩次，用蒸餾水35 mL溶解備用；同上再制備1份菌體細胞，對菌體細胞溶液進行細胞超聲波破碎后冷凍離心，將離心后的上清液用孔徑為0.2μm的過濾膜過濾，然后溶于蒸餾水35 mL制成胞內液，備用。分別在等量的黑曲霉菌體細胞溶液、胞內物質、胞外粗提液中加入AFB12μm，在37℃的培養(yǎng)箱中反應2 d；以等量的蒸餾水加AFB1為對照組。

2.4 黃曲霉毒素降解菌株的應用

2.4.1 急性毒理學試驗

將黑曲霉接入100 mL PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液對5只小鼠（雌雄各半）進行最大耐受試驗，每次最大給藥量為0.2 mL·只-1·10 g-1，灌胃給藥3次·d-1，24 h后觀察小鼠表現(xiàn)；對5只小鼠經口灌胃蒸餾水作為對照組。

2.4.2 發(fā)霉飼料中黃曲霉毒素降解試驗

取飼料500 g和蒸餾水200 mL充分混勻，在37℃的恒溫箱中放置21 d制得發(fā)霉飼料。取黑曲霉發(fā)酵液50 mL和發(fā)霉飼料混勻，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每隔12 h充分混勻1次。檢測對比發(fā)霉飼料中發(fā)酵前后AFB1的含量。

2.5 AFB1的提取與檢測

AFB1的提取參照GB/T8381-2008/ISO6651：2001。AFB1的檢測采用三氟乙酸柱前衍生后HPLC檢測方法。

HPLC檢測條件為流動相乙腈∶水=3∶7；流速1 mL·min-1；色譜柱C18 4.6 mm×250 mm，0.5 μL；柱溫為室溫；激發(fā)波長360 nm，檢測波長440 nm；進樣量20μL。AFB1降解率的計算公式見式1。

3 結果與分析

3.1 AFB1標準品的液相色譜圖

AFB1標準品的液相色譜圖見圖1。

圖1 AFB1標準品的色譜

由圖1可以看出，AFB1的保留時間為11.30 min。

3.2 黑曲霉對AFB1的降解：

黑曲霉對AFB1的降解見圖2～3。

由圖2～3可以看出，代表AFB1的色譜峰顯著減?。≒＜0.05）。HPLC檢測計算得出黑曲霉對AFB1降解率達93.28%。在相同培養(yǎng)基中有無黑曲霉對AFB1含量的變化表明，該降解完全是由黑曲霉的生長引起的，與PDB培養(yǎng)基的吸附作用無關。

圖2 對照組色譜圖

圖3 試驗組色譜圖

3.3 降解曲線的測定

黑曲霉不同時間對菌株毒素降解率的影響結果見圖4。由圖4可見，在前12 h內，AFB1的降解率升高很快，可能與菌體吸附有關，隨著時間的延長，AFB1的降解率升高幅度減慢，可能主要由黑曲霉產生的活性物質作用所致。

圖4 黑曲霉對AFB1的降解曲線

3.4 黑曲霉降解AFB1活性組分的確定

對照組（含AFB1的蒸餾水）的色譜圖、胞內物質對AFB1降解后的色譜圖、菌體細胞對AFB1降解后的色譜圖、胞外粗提液對AFB1降解后的色譜圖分別見圖5～9。

圖5 對照組（含AFB1的蒸餾水）色譜圖

圖6 胞內物質對AFB1降解后色譜圖

圖7 菌體細胞對AFB1降解后色譜圖

圖8 胞外粗提液對AFB1降解后色譜圖

圖9 黑曲霉的不同處理對降解AFB1的結果

由圖5～9可以看出，胞外粗提液AFB1降解能力最強，降解率達到84.20%，菌體細胞的降解能力次之，降解率達到38.40%，胞內物質的降解能力最差，降解率為3.33%，基本無降解能力。黑曲霉菌體細胞對樣品中AFB1的消除可能是運用細胞壁的物理吸附作用，胞內物質、胞外粗提液是運用生物學方法來解毒，主要通過轉化AFB1的結構來達到降解作用。從HPLC的結果來看，胞外粗提液降解AFB1后，其產物的特征熒光顯著減弱，推測是一種酶裂解了內酯環(huán)。由此可以認為，黑曲霉降解AFB1起作用的主要是胞外粗提液中的一種生物活性酶，黑曲霉對AFB1的降解過程實質上應是降解酶的酶促反應。

3.5 黑曲霉發(fā)酵液對發(fā)霉飼料的作用

黑曲霉發(fā)酵液對發(fā)霉飼料的作用見圖10～11。

圖10 霉變飼料處理前的色譜

由圖10可以看出，霉變飼料中有大量熒光物質，包括AFB1。由圖11可以看出，霉變飼料中的很多熒光物質被降解，AFB1已接近0。經過黑曲霉發(fā)酵液對發(fā)霉飼料的處理，其中AFB1的含量遠低于國家標準中飼料AFB1的超標量（≤10 μg·kg-1）[5]。黑曲霉及其產生的活性物質降解其中AFB1作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質，而且具有操作簡單、成本低等優(yōu)點，適合在飼料方面規(guī)模應用。

圖11 霉變飼料處理后的色譜

3.6 急性毒性試驗

經觀察，灌服小鼠無死亡現(xiàn)象，也未出現(xiàn)任何中毒現(xiàn)象。3 d后處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎，均無特殊改變。小鼠最大耐受量的測定主要考察小鼠在藥物單次給藥或24 h內多次給藥后的急性毒性情況，可對黑曲霉發(fā)酵液的安全性進行初步評價[6]?？梢姶朔N黑曲霉對小鼠并無顯著的急性毒副作用。黑曲霉在國際上公認安全性高，已在食品及飼料發(fā)酵的生產中廣泛使用。因此，可以認為采用的微生物降解AFB1工藝在安全性方面無需擔心。

4 討論

黃曲霉毒素自從20世紀60年代被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其危害越來越重視，雖然已研發(fā)、推廣了一些脫毒或降解毒素的方法，但都有弊端。近年來，人們希望用簡單、便捷、溫和的方法來去除黃曲霉毒素，紛紛把研究重點向微生物降解方面發(fā)展。從國際上的報道來看，霉菌毒素的微生物降解研究有了很大進展，尤其是黃曲霉毒素去除的研究，但仍存在一些問題，例如微生物的降解過程緩慢，安全性不確定，有效組分解毒酶的復雜性，這些因素限制了在實際生產應用[7-14]?，F(xiàn)在實際生產應用的多是菌體的吸附作用（啤酒酵母、乳酸菌等對毒素的吸附），研究證明，主要是菌體細胞壁與黃曲霉毒素通過非共價方式結合的，這種吸附作用沒有達到真正去除AFB1的目的。微生物降解霉菌毒素不同于物理吸附，降解是霉菌毒素分子的毒性基團被微生物產生的次級代謝產物或者所分泌的胞內、胞外酶分解破壞，同時產生無毒的降解產物的過程[15]。孫豐芹等利用營養(yǎng)特異性方法進行去除AFB1菌株的初篩，之后將初篩的7株菌細胞和發(fā)酵上清液作用于質量濃度為200 μg·L-1的AFB1，結果表明，篩選得到的TRS-3菌株，其活細胞和死細胞對AFB1的去除率分別達到48.26%和53.56%，其發(fā)酵上清液降解AFB1的能力達到78.55%，均高于其他菌株，從花生土壤和花生粕中也篩選出能去除黃曲霉毒素B1（AFB1）的菌株[16]。

高效液相色譜法是當前國際上使用權威的檢測AFB1方法，因此本研究采用高效液相色譜法對AFB1進行檢測，為了加強熒光，通過強氧化劑三氟乙酸柱前進行衍生處理[17]。經過高效液相色譜的檢測，表明黑曲霉及產生的活性物質能夠很好的降解AFB1，而且菌體能夠吸附一定量的AFB1。另外，徐丹等還發(fā)現(xiàn)黑曲霉能有效抑制黃曲霉的生長與繁殖，從而達到抑制黃曲霉產毒的作用[18]。由此可見，黑曲霉不僅能夠產生活性物質降解AFB1，同時也會產生抑制黃曲霉生長和繁殖的物質，這在防霉去霉過程中有很大的作用，也對以后開發(fā)研制高效、廣譜、無毒的天然防霉劑和生物降解劑提供理論基礎。

5 結論

本試驗通過對有益菌株的篩選，得到降解AFB1效果最佳的一種黑曲霉，其對AFB1的降解率達93.28%，起降解作用的主要是一種生物活性酶，且菌體細胞對AFB1也有一定的吸附作用，從小鼠的急性毒性試驗和發(fā)霉飼料中霉菌毒素的降解來看，黑曲霉及其產生的活性物質對AFB1生物降解作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質，而且具有操作簡單、成本低等優(yōu)點，運用在飼料中降解霉菌毒素有很大的開發(fā)潛力。

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