馮俊霞 陸敏 郭瑞霞 戚秀菊

摘要：以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，用熒光分光光度法測(cè)定中藥材紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）中總黃酮含量，該方法的檢出限為２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ，線性回歸方程為ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８，相關(guān)系數(shù)Ｒ２＝０．９９９ ０３，線性范圍為６．７×１０－６～６．０×１０－４ ｇ／Ｌ；紫菀中總黃酮的平均含量為４．８９６×１０－３ ｇ／Ｌ，樣品測(cè)定的ＲＳＤ為０．９２％，平均回收率為９３．１９％。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，可以為中藥材紫菀質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）；總黃酮；熒光分光光度法

中圖分類號(hào)：Ｏ６５７．３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3323-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ Ｒａｄｉｘ Ａｓｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

ＦＥＮＧ Ｊｕｎ－ｘｉａa，ＬＵ Ｍｉｎa，ＧUO Ｒｕｉ－ｘｉａa，ＱＩ Ｘｉｕ－ｊｕb

（Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， a．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； b．Ａｄｍｉｎｓｔａｔｉｖｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｔａｔｅ Ｏｗｎｅｄ Ａｓｓｅｔｓ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００３５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ Aｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ， ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ６．７×１０－６～６.0×１０－４ ｇ／Ｌ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８， and ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２ was ０．９９９ ０３． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ ｗａｓ ４．８９６×１０－３ ｇ／Ｌ， and ＲＳＤ was ０．９２％， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９３．１９％． Ｉｔ ｉｓ a ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒimetry． Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｄｉｘ Ａｓｔｅｒ（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ； ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

紫菀是菊科多年生草本植物紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）的干燥根及莖，具有潤(rùn)肺下氣、祛痰止咳之功效［１，２］，是河北省的道地藥材之一［３］。黃酮類化合物是其主要藥理活性成分，主要有槲皮素、山萘酚等［１，２，４］。本試驗(yàn)以槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用熒光分析法對(duì)紫菀中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，為中藥材紫菀的質(zhì)量控制提供參考。

１材料與方法

１．１材料與試劑

紫菀，２０１１年１月購于石家莊新興藥房，由石家莊學(xué)院馮海燕副教授鑒定為菊科植物紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）的干燥根及莖，該藥材在６０ ℃真空干燥５ ｈ，取出粉碎，置干燥器中備用。槲皮素對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供，經(jīng)１２０ ℃真空干燥４ ｈ，取出置于干燥器中冷卻備用。Ａｌ（ＮＯ３）３·９Ｈ２Ｏ容易潮解，使用前５０ ℃真空干燥６ ｈ。綠原酸由中國藥品生物制品檢定所提供。所用試劑均為分析純。

１．２主要儀器

Ｆ－４５００型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；ＫＱ３２００ＤＥ型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；雷磁ＰＨＳ－３ＣＰＨ計(jì)、ＦＡ２２０４Ｂ電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ＤＺ－１ＢＣ真空干燥箱、ＦＷ１００高速萬能粉碎機(jī)、ＤＫ－９８－１型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１樣品溶液的制備稱取粉碎的紫菀樣品５．００ ｇ，置于２５０ ｍＬ三角瓶中，加入１５０ ｍＬ ６０％乙醇，浸泡５ ｈ，用超聲波破碎提取，參照文獻(xiàn)［５］的方法并有所改進(jìn)：超聲溫度為４０ ℃，料液比１∶３０（質(zhì)量體積比），超聲時(shí)間為４０ ｍｉｎ，連續(xù)提取３次；提取完畢后，真空抽濾，合并３次濾液，６０％乙醇定容至２５０ ｍＬ，待測(cè)。

１．３．２槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取槲皮素對(duì)照品０．００１ ５ ｇ，用７０％乙醇溶解，定容至１００ ｍＬ容量瓶中，配成濃度為１．５×１０－２ ｇ／Ｌ的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸?。?ｍＬ １．５９８ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮO３）３溶液，分別置于６只２５ ｍＬ容量瓶中，各容量瓶中依次加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ，再加入２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５），用７０％的乙醇定容搖勻，室溫下靜置３０ ｍｉｎ，待測(cè)。

１．３．３測(cè)定在激發(fā)光譜通帶２．５ ｎｍ、發(fā)射光譜通帶５ ｎｍ、激發(fā)波長(zhǎng)λｅｘ＝４３６ ｎｍ、發(fā)射波長(zhǎng)λｅｍ＝４８６ ｎｍ的條件下測(cè)定系列槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，然后在相同條件下測(cè)定紫菀樣品溶液中總黃酮的熒光強(qiáng)度，利用回歸方程計(jì)算其含量。

２結(jié)果與分析

２．１熒光化合物的激發(fā)及發(fā)射光譜

按照試驗(yàn)方法，配制濃度為３×１０－４ ｇ／Ｌ的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的合適激發(fā)光譜通帶２．５ ｎｍ，發(fā)射光譜通帶５ ｎｍ?xiàng)l件下，對(duì)其激發(fā)及發(fā)射光譜進(jìn)行掃描，所得激發(fā)及發(fā)射光譜見圖１。

２．２測(cè)定條件的選擇

２．２．１溶劑的確定準(zhǔn)確吸?。?ｍＬ １．５９８ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液，加入１ ｍＬ １．５×１０－２ ｇ／Ｌ槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５），１ ｍＬ １％ β－ＣＤ，分別用５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇定容至２５ ｍＬ，搖勻，室溫下靜置６０ ｍｉｎ，在發(fā)射波長(zhǎng)４８６ ｎｍ處測(cè)定熒光強(qiáng)度。從圖２可知，在４８６ ｎｍ處槲皮素－鋁配合物的熒光強(qiáng)度隨著乙醇濃度的增加而增加，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到８０％時(shí)，最大峰位置明顯向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。從測(cè)定結(jié)果及節(jié)約溶劑的角度出發(fā)，確定７０％乙醇為測(cè)定溶劑。

２．２．２ｐＨ的確定按照上述方法，用７０％乙醇作溶劑，分別在ｐＨ ２．６５、３．３６、４．３７、５．１９時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度。從測(cè)定結(jié)果（圖３）可知，隨著ｐＨ的升高，槲皮素－鋁配合物的熒光強(qiáng)度迅速降低，ｐＨ ２．６５時(shí)最大熒光強(qiáng)度為４０１．７，至ｐＨ ５．１９時(shí)已經(jīng)降低為６２．7；且最大峰位置不斷向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，至ｐＨ ５．１９時(shí)，已經(jīng)由ｐＨ ２．６５時(shí)的４８６ ｎｍ移動(dòng)至５３１．４ ｎｍ。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果，在本試驗(yàn)中加入２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５）。

２．２．３表面活性劑的確定選擇了不加表面活性劑和加入３種不同的表面活性劑（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、β－ＣＤ，濃度均為１％）來比較表面活性劑對(duì)槲皮素－鋁配合物熒光強(qiáng)度的影響。從圖４可知，加入表面活性劑并不改變峰的位置，ＳＤＳ對(duì)熒光有熄滅作用，β－ＣＤ和ＣＴＡＢ沒有明顯的增敏作用，因此在試驗(yàn)中選擇不添加表面活性劑。

２．２．４溫度的確定在上述選定的溶劑、ｐＨ條件下改變反應(yīng)溫度，分別在１３、３３、５３和７３ ℃下測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。從圖５可以得出，溫度能夠顯著影響體系的熒光強(qiáng)度，隨溫度的升高，體系的熒光強(qiáng)度顯著降低，室溫時(shí)最大熒光強(qiáng)度為４２６，而在７３ ℃時(shí)僅為２０３．２。溫度對(duì)峰位置不產(chǎn)生影響，因此選擇在室溫下進(jìn)行測(cè)定。

２．２．５反應(yīng)時(shí)間的確定改變反應(yīng)時(shí)間，在２０、４０、６０、８０和１００ ｍｉｎ ５個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定槲皮素對(duì)照品的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖６所示，溶液的熒光強(qiáng)度在２０～４０ ｍｉｎ內(nèi)基本保持穩(wěn)定且數(shù)值最高，在４０ ｍｉｎ之后，熒光強(qiáng)度呈緩慢下降趨勢(shì)，因此，選擇３０ ｍｉｎ為最佳測(cè)定時(shí)間。

２．２．６金屬離子和綠原酸的干擾測(cè)定結(jié)果一些金屬離子和有機(jī)酸對(duì)鋁離子和槲皮素的結(jié)合存在配位競(jìng)爭(zhēng)干擾，在上述選定的試驗(yàn)條件下，考察了常見的金屬離子Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋和綠原酸對(duì)試驗(yàn)的影響。從圖７可知，Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋對(duì)測(cè)定沒有干擾，Ｃｕ２＋使測(cè)定結(jié)果偏低，而Ｆｅ３＋的干擾最大，嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果；綠原酸使測(cè)定結(jié)果偏高。

２．３標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在選定的最佳試驗(yàn)條件下，測(cè)得在６．７×１０－６～６．０×１０－４ ｇ／Ｌ范圍內(nèi)槲皮素濃度與其熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８，相關(guān)系數(shù)Ｒ２＝０．９９９ ０３。通過測(cè)定試劑空白溶液１２次，依據(jù)公式ＣＬＯＤ＝３Ｓ／Ｋ（Ｓ為空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，Ｋ為工作曲線斜率）計(jì)算方法檢出限為２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖８。

２．４樣品測(cè)定及精密度

按上述試驗(yàn)方法測(cè)定了紫菀中總黃酮的含量，并對(duì)樣品溶液進(jìn)行平行測(cè)定（ｎ＝５），結(jié)果見表１，方法精密度良好。

２．５加標(biāo)回收率

為了驗(yàn)證試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，做了加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表２，方法準(zhǔn)確性良好。

３小結(jié)與討論

利用熒光法測(cè)定中藥材紫菀中的總黃酮含量，結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高；而且該方法操作簡(jiǎn)便，樣品使用量少，測(cè)定成本較中藥材黃酮含量測(cè)定常用的高效液相色譜法低，是一種比較實(shí)用的方法。

熒光分析受到許多因素的限制（ｐＨ值、溫度、溶劑濃度等），所以該方法必須是在特定的條件下使用。中藥材成分比較復(fù)雜，成分之間相互作用，對(duì)熒光分析結(jié)果可能產(chǎn)生影響，因此應(yīng)加強(qiáng)提取過程研究。

參考文獻(xiàn)：

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