劉德勝 鄭紅 韓景田
摘要:從茅莓(Rubus parvifolius L.)中提取總黃酮,采用吸光光度法測(cè)定提取液中總黃酮的濃度。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲處理時(shí)間及提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明,茅莓莖中總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1∶50(m∶V,g/mL)、提取溫度80 ℃、超聲處理時(shí)間90 min,此工藝條件下茅莓莖中總黃酮提取率為4.7 mg/g,此時(shí)葉中總黃酮的提取率高達(dá)12.2 mg/g,遠(yuǎn)高于根和莖中的。
關(guān)鍵詞:茅莓(Rubus parvifolius L.);總黃酮;提取工藝;優(yōu)化
中圖分類號(hào):R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)15-3295-03
Optimization of Extraction Technology of Total Flavones from Rubus parvifolius
LIU De-sheng,ZHENG Hong,HAN Jing-tian
(School of Pharmacy,Binzhou Medical College,Yantai 264003,Shandong,China)
Abstract: Total flavonoids were extracted from Rubus parvifolius L., the concentration of flavones in extractant was detected by spectrophotometry. The effects of solid to liquid ratio, extraction time, volume fraction of alcohol solvent and extraction temperature were studied through L9(34) orthogonal test on the basis of single factor tests. The results showed that the optimum extraction conditions were, volume fraction of ethanol solution, 30%; solid-liquid ratio, 1∶50(m∶V,g/mL); extraction temperature, 80 ℃; extraction time, 90 min. Under these conditions, the yield of total flavonoids in R. parvifolius stem reached 4.7 mg/g. The extraction yield of total flavonoids in R. parvifolius leaf was 12.2 mg/g, much higher than that in the stem and root.
Key words: Rubus parvifolius L.; total flavones; extraction technology; optimization
茅莓(Rubus parvifolius L.)又名紅梅消、天青地白草等,系薔薇科懸鉤子屬落葉小灌木,生于山坡、路旁荒地、灌叢和草叢中,適應(yīng)性強(qiáng),分布于河北、山西、陜西、四川以及中南和華東各省,資源十分豐富[1]。茅莓為民間常用草藥,其根、莖、葉均可作藥用,具有清熱涼血、止血、散結(jié)止痛、利尿消腫等功效[2]。茅莓含有皂苷[3,4]、黃酮[5]、酚酸類物質(zhì)[6]、萜類[7]以及揮發(fā)油[8]等多種有效成分,其中黃酮類化合物具有良好的抗氧化性能,具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老、增加機(jī)體免疫力、降血壓、降血脂及抗腫瘤等功能[8],茅莓的功效與其所含黃酮類化合物有著密切聯(lián)系。本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化茅莓中總黃酮的提取工藝,以期為進(jìn)一步綜合利用茅莓資源提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
茅莓采自山東省煙臺(tái)市昆崳山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院劉孟安教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物茅莓(Rubus parvifolius L.)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(100080-200306)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,AlCl3、甲醇、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。
TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化設(shè)備儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);D2F-6050型真空干燥箱、PHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司);HY40B型高速粉碎機(jī)(北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司);EL204-電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);WD-2105A微型離心機(jī)(北京市六一儀器廠)。
1.2方法
1.2.1樣品預(yù)處理將茅莓莖洗凈后置烘箱中80 ℃烘干、粉碎、過60目篩,得試驗(yàn)用粉末樣品,陰涼干燥處密閉保存。稱?。保埃?g樣品,石油醚(沸程60~90 ℃)回流2~4 h脫色素,進(jìn)行多次脫色至石油醚無色,過濾,濾渣烘干。
1.2.2超聲輔助法提取茅莓中的總黃酮稱取預(yù)處理后的茅莓莖粉末1.0 g,置250 mL三角瓶中,加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,稱重,設(shè)定超聲功率和溫度,超聲處理一定時(shí)間后取出放至室溫,稱重,用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇補(bǔ)充至原重。過濾,得茅莓總黃酮提取液。
1.2.3單因素試驗(yàn)以黃酮提取率為指標(biāo),設(shè)置單因素試驗(yàn)分別考察料液比、提取溫度、超聲處理時(shí)間、乙醇濃度的影響。①料液比。提取溫度60 ℃、超聲處理時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(m∶V,g/mL,下同)。②提取溫度。料液比1∶40、超聲處理時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取溫度分別為50、60、70、80 ℃。③超聲處理時(shí)間。料液比1∶40、提取溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,超聲處理時(shí)間分別為30、60、90、120 min。④乙醇體積分?jǐn)?shù)。料液比1∶40、提取溫度70 ℃、超聲處理時(shí)間120 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%。
1.2.4正交試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)考察料液比、提取溫度、超聲處理時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響,因素與水平見表1。
1.2.5總黃酮含量的測(cè)定[9-11]①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品,用無水甲醇配成濃度為140.0 μg/mL的對(duì)照品溶液,準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,加10 g/L AlCl3溶液0.5 mL,搖勻,放置15 min,以無水甲醇定容至10 mL,以空白作為對(duì)照,15 min后于425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。得到吸光度(A)對(duì)濃度(C//μg/mL)的回歸方程A=323.287 64C-0.770 46,R2=0.999 8,線性范圍為1.4~14.0 μg/mL。②樣品中總黃酮含量的測(cè)定。取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法顯色,測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程求出提取液中總黃酮的濃度,并利用下式求出總黃酮提取率。
W=C×N×V/m×10-3
式中,W為總黃酮的提取率(mg/g),N為稀釋倍數(shù),V為提取液總體積(mL),m為茅莓莖的質(zhì)量(g),C為總黃酮提取液的濃度(μg/mL)。
2結(jié)果與分析
2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1料液比對(duì)茅莓總黃酮提取率的影響由圖1可知,隨著提取劑乙醇用量的增加,茅莓總黃酮提取率先增加,料液比為1∶40時(shí)總黃酮提取率最高。當(dāng)黃酮類物質(zhì)完全溶出之后,再加大提取劑的用量,總黃酮的提取率略有下降,且不利于后期的產(chǎn)物濃縮和提純。
2.1.2提取溫度對(duì)茅莓總黃酮提取率的影響由圖2可知,總黃酮提取率隨著提取溫度的升高而升高,但提取溫度高于70 ℃時(shí),提取率隨溫度升高而升高的趨勢(shì)變得平緩。較高的提取溫度有利于有效成分的溶出,但過高的溫度會(huì)引起總黃酮的降解,反而降低提取效率。
2.1.3提取時(shí)間對(duì)茅莓總黃酮提取率的影響由圖3可知,茅莓總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈升高趨勢(shì),提取時(shí)間由50 min延長(zhǎng)至60 min時(shí),提取率的上升幅度較大。但當(dāng)提取時(shí)間長(zhǎng)于60 min時(shí),提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高的幅度較小。
2.1.4乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茅莓總黃酮提取率的影響由圖4可知,總黃酮提取率隨提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率最高,過高或過低的提取劑濃度都不利于總黃酮的溶出。
2.2正交試驗(yàn)結(jié)果
正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知,4因素中料液比對(duì)黃酮提取率的影響最大,提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)次之,超聲處理時(shí)間的影響最小。方差分析結(jié)果表明,料液比、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茅莓莖中總黃酮提取率的影響顯著,而超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮的提取率沒有顯著影響。茅莓總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B3C3D1,即料液比1∶50,提取溫度80 ℃,超聲處理時(shí)間120 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)30%。由于超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著,從節(jié)約試驗(yàn)成本簡(jiǎn)化操作的角度考慮,在實(shí)際操作中選用90 min的處理時(shí)間。在此條件下總黃酮的提取率為4.7 mg/g,高于其他試驗(yàn)組合。按此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),從茅莓莖中提取總黃酮,重復(fù)3次,總黃酮的提取率分別為4.8、4.7、4.6 mg/g,說明正交試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。
2.3茅莓不同部位總黃酮含量的測(cè)定
精確稱取干燥的茅莓根、莖、葉粉末各1.0 g,按正交試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝提取總黃酮,根、莖、葉中總黃酮的提取率分別為4.2、4.7、12.2 mg/g,表明茅莓的葉片中總黃酮的含量和提取率遠(yuǎn)高于根和莖中的,可作為茅莓總黃酮提取的主要取材部位。
3結(jié)論
通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),優(yōu)化得到茅莓莖中總黃酮的提取工藝為料液比1∶50(m∶V,g/mL)、提取溫度80 ℃、超聲處理時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%,此時(shí)茅莓總黃酮提取率最高,為4.7 mg/g。提取工藝穩(wěn)定性和重復(fù)性好、簡(jiǎn)單可行、省時(shí)節(jié)能,適于工業(yè)化生產(chǎn)。茅莓葉中的總黃酮含量和提取率遠(yuǎn)高于根和莖中的,這為茅莓資源的利用和進(jìn)一步開發(fā)提供了依據(jù)。
參考文獻(xiàn):
[1] 俞德?。袊?guó)植物志:第37卷[M].北京:科學(xué)出版社,1985.61.
[2] 任凌燕,李惠芝,邱宗蔭,等.茅莓的生藥學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,18(1):49-50.
[3] 都述虎,劉文英,饒金華,等. 制備型HPLC法分離2個(gè)茅莓皂苷單體成分[J]. 中草藥,2005,36(3):348-350.
[4] 鄭振汶,黃常新,黃巧玲,等. 茅莓總皂苷抗腫瘤作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,24(5):639.
[5] 汪 瑗,賀玖明,陳 惠,等. 茅莓黃酮液相色譜—電噴霧質(zhì)譜與薄層色譜—表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J].分析化學(xué),2006,34(8):1073-1077.
[6] 譚明雄,王恒山,黎霜,等. 中藥茅莓化學(xué)成分研究[J]. 廣西植物,2003,23(3):282-284.
[7] 王先榮,杜安全,王紅萍. 中藥茅莓的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,1994,19(8):486-487.
[8] 譚明雄,王恒山. 茅莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(1):32-33.
[9] 項(xiàng)昭保,任紹光,石軼松,等.吸光光度法測(cè)定蕎麥秸中總黃酮[J]. 理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)),2002,38(9):436-437.
[10] 何文靜,楊建,劉潔. 超聲波法提取啤酒花中總黃酮的工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(7):4039-4040.
[11] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(二部)[Z]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.