馮志國 劉慧娟

摘要：采用免疫膠體金電鏡技術(shù)研究光暗適應(yīng)條件下不同Ｃａ２＋濃度對(duì)羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基亞細(xì)胞定位的影響。結(jié)果表明，對(duì)于光適應(yīng)組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細(xì)胞質(zhì)與感桿束中膠體金密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。對(duì)于暗適應(yīng)組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細(xì)胞質(zhì)與感桿束中膠體金密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。這些表明了羅氏沼蝦感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應(yīng)條件下同時(shí)分配在感桿束和細(xì)胞質(zhì)中。在光照和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基進(jìn)而轉(zhuǎn)化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）；感光細(xì)胞；Ｇｑ蛋白；Ｃａ２＋；免疫膠體金電鏡

中圖分類號(hào)：Ｑ９５９．２２３＋６３；Ｒ４４６．６１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－4141-03

Effects of Ca2+ Concentration on Subcellular Localization of Gq Protein α Subunit in Macrobrachium rosenbergi

ＦＥＮＧ Ｚｈｉ－ｇｕｏ，ＬＩＵ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｒｈａｂｄｏｍ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．５１， ２．１３ ａｎｄ ０．９３， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｈｉｇｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．０１， １．０８ ａｎｄ ０．４７， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｇｑ pｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｏｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒｈａｂｄｏｍ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ； ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ； Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃａ２＋； ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ

免疫膠體金電鏡是研究生物大分子在亞細(xì)胞水平的定位、進(jìn)一步探討大分子功能的最重要技術(shù)之一，ＩｇＧ具有雙價(jià)性，它的一臂可結(jié)合到事先包被有抗原的膠體金上，也可以把抗體分子包被在膠體金上對(duì)細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定位。該技術(shù)首先用膠體金顆粒對(duì)抗原的抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后用標(biāo)記抗體對(duì)組織超薄切片進(jìn)行免疫反應(yīng)，有抗原存在的細(xì)胞結(jié)構(gòu)即被膠體金顆粒標(biāo)記，在電鏡下根據(jù)膠體金顆粒的分布情況及密度即可確定抗原的亞細(xì)胞分布及相對(duì)含量。近年來膠體金探針己成為定位和分析多種蛋白質(zhì)、多肽、多糖的有力工具，特別是在抗原酶及激素等物質(zhì)的細(xì)胞免疫化學(xué)定位中更加顯示了其獨(dú)特的作用。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基有可溶性和膜結(jié)合兩種形式［１，２］，Ｇｑ蛋白α亞基在光感覺生理中的作用不僅取決于不同形式Ｇｑ蛋白α亞基含量的變化，而且與其在細(xì)胞內(nèi)的分布密切相關(guān)［３－５］。采用生理生化的方法能測定不同形式Ｇｑ蛋白α亞基的含量，而采用免疫定位可以反映其細(xì)胞及亞細(xì)胞分布變化。采用免疫膠體金電鏡技術(shù)研究光暗適應(yīng)條件下不同Ｃａ２＋濃度對(duì)羅氏沼蝦感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基的影響，以期從亞細(xì)胞水平揭示Ｃａ２＋與Ｇｑ蛋白α亞基之間的關(guān)系，為闡明Ｇｑ蛋白α亞基的作用機(jī)制及Ｃａ２＋在光感覺生理中的作用打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

羅氏沼蝦購買于上海市漕河涇農(nóng)貿(mào)市場，試劑、藥品均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。兔抗Ｇｑ蛋白α亞基的抗血清Ｃ端序列（ＩＭＹＳＨＬＶＤＹＦＰＥＹＤＧＰＱＲ）購買于美國Ｂｉｏｄｓｉｇｎ公司。

１．２方法

１．２．１樣品的處理將購買來的１２只羅氏沼蝦隨機(jī)平均分成２組飼養(yǎng)在河水中，一組于自然光下飼養(yǎng)６ ｈ后在自然光下解剖復(fù)眼，另一組于全暗的環(huán)境中飼養(yǎng)６ ｈ后在微弱的紅光下解剖復(fù)眼。獲取視網(wǎng)膜并放入孵育杯待用。將活的視網(wǎng)膜分別放入配制的生理溶液、高Ｃａ２＋溶液和低Ｃａ２＋溶液中。將兩組樣品（暗處理組的樣品用遮光紙包?。┒挤旁冢?℃下孵育２４ ｈ。

１．２．２樣品的超薄切片取視紫紅質(zhì)部分迅速放入固定液（４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛和體積分?jǐn)?shù)為０．５％的戊二醛）中，于４ ℃過夜。另一組在微弱的紅光下取視紫紅質(zhì)部分迅速放入固定液中，于４ ℃過夜。用磷酸鹽緩沖液和含有０．３ ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸的磷酸鹽緩沖液分別清洗樣品，然后用乙醇和丙酮脫水。用Ｅｐｏｎ８１２樹脂包埋、聚合后，再把切好的超薄切片收集在鎳鉻網(wǎng)面上。

１．２．３樣品的免疫標(biāo)記和電鏡觀察將鎳鉻網(wǎng)面向下漂浮在含體積分?jǐn)?shù)為1％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的磷酸鹽緩沖液液滴上孵育３０ ｍｉｎ，轉(zhuǎn)移鎳鉻網(wǎng)到封閉液液滴表面上孵育１ ｈ，轉(zhuǎn)移鎳鉻網(wǎng)到一抗液滴表面上，于４ ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液輕洗鎳鉻網(wǎng)面３次，每次５ ｍｉｎ，轉(zhuǎn)移鎳鉻網(wǎng)到交聯(lián)膠體金顆粒的二抗液滴表面上孵育１ ｈ。用磷酸鹽緩沖液輕洗鎳鉻網(wǎng)面３次，每次５ ｍｉｎ，在室溫下轉(zhuǎn)移鎳鉻網(wǎng)到含體積分?jǐn)?shù)為１％戊二醛的磷酸鹽緩沖液液滴上固定３０ ｍｉｎ，用磷酸鹽緩沖液清洗鎳鉻網(wǎng)面３次，每次３ ｍｉｎ，用去離子水清洗鎳鉻網(wǎng)面３次，每次３ ｍｉｎ。用醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，于７５ ｋＶ下用ＨＩＴＡＣＨＩＨ－６００透射電鏡觀察、拍照。

２結(jié)果與分析

由表１可知，對(duì)于光適應(yīng)組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細(xì)胞質(zhì)與感桿束中膠體金顆粒密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。對(duì)于暗適應(yīng)組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細(xì)胞質(zhì)與感桿束中膠體金顆粒密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。由圖1和表1可知，羅氏沼蝦感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應(yīng)條件下同時(shí)分配到感桿束和細(xì)胞質(zhì)中。在光照和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基進(jìn)而轉(zhuǎn)化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。

３小結(jié)與討論

羅氏沼蝦感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應(yīng)條件下同時(shí)分配到感桿束和細(xì)胞質(zhì)中。在光照和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基進(jìn)而轉(zhuǎn)化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。Ｇｑ蛋白α亞基亞細(xì)胞定位的變化是去十六酞化物的作用所導(dǎo)致的［５］。

免疫膠體金電鏡技術(shù)現(xiàn)己在免疫化學(xué)和組織化學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，膠體金顆粒之所以能成為電鏡下較為理想的免疫標(biāo)記物，是因?yàn)樗饕腥缦聝?yōu)勢：①膠體金顆粒在電鏡下具有很高的電子密度，大小顆粒清晰可辨，且不影響對(duì)原有超微結(jié)構(gòu)的觀察。②通過計(jì)量被檢部分的膠體金顆粒，可以對(duì)被檢抗原或抗體進(jìn)行免疫定量研究。

有一些關(guān)于異源三聚體Ｇ蛋白十六酞化物位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位之間相沖突的關(guān)系的報(bào)道，研究認(rèn)為從堅(jiān)持α亞基的膜定位到堅(jiān)持從膜到細(xì)胞溶質(zhì)的活化依賴移位是去十六酞化物的作用導(dǎo)致［６］。對(duì)無脊椎動(dòng)物感光器中Ｇｑ蛋白的定位研究較少，用免疫組織化學(xué)的方法在鱟側(cè)眼的冰凍切片中觀察免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，ＦＩＴＣ熒光集中在小眼的視桿部位，在小眼的視網(wǎng)膜細(xì)胞或其他細(xì)胞的胞質(zhì)中幾乎沒有免疫反應(yīng)［７］。在超微結(jié)構(gòu)定位上，用免疫膠體金標(biāo)記了感光器中的Ｇｑ蛋白α亞基，光敏感的微絨毛部位的金粒密度是胞質(zhì)部位的３倍以上。在鰲蝦的感光器中，用同樣的方法觀察Ｇｑ蛋白α亞基，在光照條件下Ｇｑ蛋白α亞基從視桿微絨毛膜上移位至胞質(zhì)中，在黑暗中又移回到視桿微絨毛膜上［７－１０］。Ｇｑ蛋白β亞基在光適應(yīng)與暗適應(yīng)時(shí)的定位模式與Ｇｑ蛋白α亞基非常相似，這表明它們定位的變化是同步的［４，５］。在多毛綱動(dòng)物感光器中，免疫膠體金電鏡技術(shù)表明Ｇｑ蛋白α亞基主要分布在視桿微絨毛的膜上。

十六酞化和去十六酞化對(duì)Ｇｑ蛋白α亞基的脂類修飾很可能是造成其形式轉(zhuǎn)變的原因［４］。己發(fā)現(xiàn)烏賊的Ｇｑ蛋白α亞基的第３、４位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基是潛在的十六酞化的位點(diǎn)。用β－巰基乙醇處理烏賊感光器時(shí)，Ｇｑ蛋白α亞基及β、γ亞基從膜上分離出來，這表明一種不穩(wěn)定的脂類修飾對(duì)Ｇｑ蛋白錨定到膜上起重要作用［６］。巰基乙醇可以解離Ｇｑ蛋白α亞基，且偶氮胂Ⅲ也可以解離鰲蝦中Ｇｑ蛋白α亞基，已知高濃度的偶氮胂Ⅲ可以裂解硫脂或酯型脂肪酸鍵，用偶氮胂Ⅲ處理烏賊的感光器膜，發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基從膜上解離出來［６］，表明硫脂的裂解產(chǎn)生了溶解性的Ｇｑ蛋白α亞基。因此推測可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基的增加是由于脂肪酸從膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基上移走，使得膜結(jié)合的Ｇｑ蛋白α亞基轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。羅氏沼蝦感光細(xì)胞中Ｇｑ蛋白α亞基的形式轉(zhuǎn)變機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 馮志國，謝素霞，劉慧娟． 鈣離子對(duì)光暗適應(yīng)羅氏沼蝦感光細(xì)胞中膜結(jié)合Ｇｑ蛋白α亞基的影響［Ｊ］． 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，１９（４）：４１１－４１３．

［２］ 馮志國，章駿，袁維佳，等． 鈣離子濃度對(duì)光暗適應(yīng)時(shí)羅氏沼蝦感光細(xì)胞中可溶性Ｇｑ蛋白α亞基的影響［Ｊ］． 動(dòng)物學(xué)研究，２００３，２４（５）：３７３－３７６．

［３］ 章駿，袁維佳，許燕． 幾種甲殼動(dòng)物感光器中的Ｇｑ蛋白α亞基的研究［Ｊ］． 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００１，１２（增刊）：７３－７８．

［４］ ＳＵＺＵＫＩ Ｔ，ＴＥＲＡＫＩＴＡ Ａ，ＮＡＲＩＴＡ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｓｑｕｉｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｉｓ ｓｔｉｍｉｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｇｑα ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｑα［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，１９９５，３７７（３）：３３３－３３７．

［５］ ＴＥＲＡＫＩＴＡ Ａ，ＴＡＫＡＨＡＭＡ Ｈ，ＴＡＭＯＴＳＵ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ｌｉｇｈｔ－ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ－ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｑ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒａｙｆｉｓｈ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］． Ｖｉｓ Ｎｅ－ｕｒｏｓｃｉ，１９９６，１３（３）：５３９－５４７．

［６］ ＣＯＯＫ Ｂ， ＢＡＲ－ＹＡＡＣＯＶ Ｍ， ＣＯＨＥＮ ＢＥＮ－ＡＭＩ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，２（５）：２９６－３０１．

［７］ ＮＡＧＹ Ｋ，ＳＴＩＥＶＥ Ｈ． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｄａｒｋ ａｄａｏｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａｒｓｅｎａｚｏ ＩＩＩ ｉｎ Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｅｃｈ，１９８３， ９（３）：２０７－２２３．

［８］ 許燕，袁維佳，趙云龍，等．紅螯螯蝦感光器中Ｇｑ蛋白的鑒定及光波長對(duì)其含量的影響［Ｊ］． 動(dòng)物學(xué)研究，２００３，２４（６）：４２９－４３４．

［９］ 袁維佳．鈣離子濃度對(duì)鱟腹神經(jīng)感光器中自動(dòng)碰擊的影響［Ｊ］． 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），１９９８，８（增刊）：７３－７７．

［１０］ 袁維佳，陳蕾，潘曉震，等． 鈣離子濃度對(duì)暗適應(yīng)時(shí)的中華絨螯蟹光感受器超微結(jié)構(gòu)的影響［Ｊ］． 動(dòng)物學(xué)研究，１９９９，２０（１）：３２－３５．

收稿日期：２０１２－０３－０１

基金項(xiàng)目：信陽師范學(xué)院青年骨干教師項(xiàng)目；河南省青年骨干教師項(xiàng)目

作者簡介：馮志國（１９７９－），男，河南安陽人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)的研究工作，（電話）０３７６－６３９１３８０，１３６３６３９２８７０（電子信箱）

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