金娜 南小寧 賀虹

摘要：以ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取的松阿扁葉蜂（Ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）基因組ＤＮＡ為模板，利用Ｌ１６（４５）正交設計對影響松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ反應的主要參數(shù)ＤＮＡ模板、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ２＋、引物和ｄＮＴＰｓ進行優(yōu)化。結(jié)果表明，松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ最優(yōu)的反應體系為２５ μＬ體系中含１.00 Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２５．００ ｎｇ／μＬ DNA模板和１０．００ μｍｏｌ／Ｌ引物。

關鍵詞：松阿扁葉蜂（Ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）；ＳＳＲ－ＰＣＲ；正交設計

中圖分類號：Ｓ７６３．４３；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4126-03

Optimization of SSR-PCR System for Acantholyda posticalis

ＪＩＮ Ｎａ，ＮＡＮ Ｘｉａｏ－ｎｉｎｇ，ＨＥ Ｈｏｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００，Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ which was ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｍａｉｎ ＰＣＲ ｆａｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ， Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｍｇ２＋， ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄＮＴＰｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｄｅｄ 1.00 Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， 3.00 ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋， ３．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ， 25.00 ｎｇ／μＬ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ２０.00 μｍｏｌ／Ｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ２５ μＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ；ＳＳＲ－ＰＣＲ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ

松阿扁葉蜂（Ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）是松樹的重要食葉害蟲之一，其１年發(fā)生ｌ代，主要為害油松、黑松、樟子松等，常將當年生和二年生針葉吃光，致使被害松林成橘褐色，嚴重時８０％以上的針葉被取食，從而嚴重影響樹木生長［１，２］。中國關于松阿扁葉蜂的研究主要集中于其生物學特性［３，４］、發(fā)生原因［５，６］、寄主選擇［７］、防治技術和預測預報［８，９］等方面，但關于該害蟲種群遺傳變異的研究至今未見報道。

微衛(wèi)星（ＳＳＲ）分子標記具有分布廣泛、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡便、檢測技術簡單及共顯性遺傳等優(yōu)點，已被廣泛應用于物種資源遺傳多樣性研究、基因分子標記以及昆蟲遺傳多樣性研究等領域。但ＳＳＲ－ＰＣＲ反應結(jié)果易受反應體系中多種因素的影響，因此需要對其擴增體系進行優(yōu)化，然后才能進行后續(xù)的試驗分析；此外，不同物種所需的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應的最佳反應體系一般也不盡相同。

在進行種群遺傳多樣性的研究中，運用正交設計方法［１０－１２］對影響松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ反應的各因素進行了優(yōu)化試驗，建立了一套適合松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ的反應體系，為應用該技術進行松阿扁葉蜂的種群遺傳多樣性分析打下基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料供試材料為２０１０年６月采自陜西省周至縣樓觀臺國家森林公園為害油松的松阿扁葉蜂幼蟲，樣品保存于體積分數(shù)為９５％的乙醇中，帶回西北農(nóng)林科技大學林學院昆蟲分子生物學實驗室進行基因組ＤＮＡ提取。

１．１．２試劑與儀器１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（無Ｍｇ２＋）、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２以及分子質(zhì)量標準ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均購自寶生物公司（大連）有限公司，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，稀釋成２０ μｍｏｌ／Ｌ。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅ Ｐｒｏ Ｓ型ＰＣＲ儀購自德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＮＤ－１０００微量紫外可見分光光度計購自美國ＮａｎｏＤｒｏｐ公司。

１．２方法

１．２．１基因組ＤＮＡ的提取和濃度測定采用改良的ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法［１３］提取松阿扁葉蜂幼蟲基因組ＤＮＡ，在１％瓊脂糖凝膠上電泳檢測提取產(chǎn)物的完整性。用ＮＤ－１０００微量紫外可見分光光度計檢測ＤＮＡ溶液的濃度和純度，并將其稀釋到２０ ｎｇ／μＬ，于－８０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２退火溫度的優(yōu)化根據(jù)預試驗結(jié)果，選定引物ＬＩＳＴ２００１［１４］用于ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系的優(yōu)化。首先在４５～６５ ℃設置４個退火溫度即４８．９、５２．７、５７．６和６１．６ ℃進行試驗，確定該引物最佳的退火溫度。ＳＳＲ－ＰＣＲ基本反應體系為：２．５ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（無Ｍｇ２＋），２ μＬ ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１ μＬ ＤＮＡ模板，２０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各１ μＬ，０．２５ μＬ ５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，２ μＬ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ，最后用無菌去離子水補足至２５ μＬ。ＳＳＲ－ＰＣＲ基本擴增程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ、４８．９ ℃／５２．７ ℃／５７．６ ℃／６１．６ ℃退火４５ ｓ、７２ ℃延伸４５ ｓ，３０個循環(huán)；最后７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。擴增產(chǎn)物于１．５％瓊脂糖凝膠上用１００ Ｖ電泳４０ ｍｉｎ，用溴化乙錠染色１０ ｍｉｎ，用去離子水脫色１０ ｍｉｎ，然后于Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝膠成像儀上照相保存。

１．２．３ＳＳＲ－ＰＣＲ正交試驗的設計針對影響ＰＣＲ反應的５個因素（ＤＮＡ模板、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物和Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶），選用Ｌ１６（４５）正交表在４個水平上進行正交試驗。設計的因素與水平見表１，２次重復。ＰＣＲ反應程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ、６１．６ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸４５ ｓ，３０個循環(huán)；最后７２ ℃延伸７ ｍｉｎ，４ ℃保存。ＰＣＲ產(chǎn)物用１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)溴化乙錠染色后于Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝膠成像儀上照相保存。

根據(jù)正交設計ＰＣＲ擴增圖譜中ＤＮＡ條帶的清晰程度與特異性（即條帶強弱及雜帶多少），參照何正文等［１５］的方法從低到高依次對每個反應結(jié)果進行打分，分值從１分到１６分，分值越高，表示敏感性、特異性越好。所有數(shù)據(jù)分析均采用ＳＰＳＳ １２．０軟件。

２結(jié)果與分析

２．１松阿扁葉蜂基因組ＤＮＡ的提取結(jié)果

松阿扁葉蜂幼蟲基因組ＤＮＡ的提取結(jié)果表明（圖１），松阿扁葉蜂基因組ＤＮＡ大小約１５ ｋｂ，主帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，ＤＮＡ濃度為５００～１ ０００ ｎｇ／μＬ，純度為１．８～２．０。

２．２不同退火溫度對ＳＳＲ－ＰＣＲ反應結(jié)果的影響

退火溫度是引物和模板結(jié)合時的溫度參數(shù)，是影響ＰＣＲ擴增特異性的重要因素。４個退火溫度下的擴增結(jié)果（圖２）表明，退火溫度較低時（泳道１和泳道２的退火溫度分別為４８．９和５２．７ ℃），引物與模板之間的錯配幾率增大，非特異性擴增條帶多并且模糊；隨著退火溫度升高（泳道３和泳道４的退火溫度分別為５７．６和６１．６ ℃），引物的特異性增加，條帶也更加清晰，引物二聚體減少。但是，退火溫度更高則會使Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶活性降低或喪失，從而導致無法擴增出條帶。

２．３SSR-ＰＣＲ反應體系的正交設計分析

依據(jù)正交設計SSR-ＰＣＲ的擴增結(jié)果（圖３），對每個擴增反應進行評分（表２），由表２可知，根據(jù)極差分析結(jié)果可知，最優(yōu)的方案為Ａ２Ｂ４Ｃ３Ｄ４Ｅ２，即松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ最優(yōu)的反應體系為２５ μＬ體系中含１.00 Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、 ２５．００ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ模板和１０．００ μｍｏｌ／Ｌ引物。

２．４正交設計中各個因素對SSR-ＰＣＲ反應的影響

２．４．１Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶用量對試驗結(jié)果的影響方差分析結(jié)果表明，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的用量是SSR-ＰＣＲ反應中最為重要的因素，不同用量對擴增結(jié)果的影響達極顯著水平（Ｐ＜０．０１）。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶用量高時不僅成本過高，而且容易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物，用量過低則會導致SSR-ＰＣＲ產(chǎn)物的合成效率下降。

２．４．２Ｍｇ２＋濃度對試驗結(jié)果的影響Ｍｇ２＋的作用主要是ｄＮＴＰ－Ｍｇ２＋與核酸骨架相互作用，影響Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的活性。Ｍｇ２＋濃度對SSR-ＰＣＲ擴增效率影響很大，濃度過高可降低SSR-ＰＣＲ擴增的特異性，濃度過低則影響SSR-ＰＣＲ擴增產(chǎn)量甚至使SSR-ＰＣＲ擴增失敗而擴增不出條帶。一般的情況下Ｍｇ２＋的濃度為０．５～５．０ ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．４．３ｄＮＴＰｓ濃度對試驗結(jié)果的影響ｄＮＴＰｓ的質(zhì)量和濃度與ＰＣＲ擴增效率有密切關系，方差分析結(jié)果顯示ｄＮＴＰｓ對試驗結(jié)果的影響達到顯著水平（Ｐ＜０．０５）。ｄＮＴＰｓ濃度過高會擴增出片狀拖帶或涂抹帶，ｄＮＴＰｓ能與Ｍｇ２＋結(jié)合，使游離的Ｍｇ２＋濃度降低。ｄＮＴＰｓ濃度低時ＰＣＲ產(chǎn)率及特異性均增高。若ｄＮＴＰｓ濃度高至４～６ ｍｍｏｌ／Ｌ時，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶活力要降低２０％～３０％，即產(chǎn)生底物抑制現(xiàn)象。

２．４．４DNA模板濃度對試驗結(jié)果的影響DNA模板濃度是制約擴增產(chǎn)物獲得率及特異性的重要因素。DNA模板濃度過低，分子碰撞的機率會降低，擴增產(chǎn)物少或不穩(wěn)定；DNA模板濃度過高，會產(chǎn)生大量非特異性擴增小片段，運用瓊脂糖凝膠電泳檢測時會有拖尾現(xiàn)象，有時候還可能會沒有ＰＣＲ條帶，特別是在DNA模板不純的時候，會對SSR-ＰＣＲ起抑制作用。

２．４．５引物濃度對試驗結(jié)果的影響引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且會增加引物之間形成二聚體的機會，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)；引物濃度過低會使擴增產(chǎn)物減少。

３小結(jié)與討論

篩選微衛(wèi)星（ＳＳＲ）引物和建立穩(wěn)定的ＳＳＲ-ＰＣＲ反應體系是ＳＳＲ分子標記檢測過程中的一個重要環(huán)節(jié)，也是ＳＳＲ多態(tài)性應用的基礎。在利用ＳＳＲ分子標記開展松阿扁葉蜂的種群遺傳多樣性的初期研究試驗中，曾對ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系中各因素分別進行了單獨的梯度試驗，但發(fā)現(xiàn)不能兼顧各因素間的交互作用，因此利用正交設計的均衡分散性和整齊可比性來解決理論上所需要的與實際可行的試驗次數(shù)的矛盾。為了確定最佳的反應體系，本研究利用松阿扁葉蜂的基因組ＤＮＡ為模板，對ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系中的幾個重要組成因素如模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋、引物以及Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶進行了多因素聯(lián)合優(yōu)化的正交試驗，由于ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系中各組分均可能對擴增的特異性、敏感性和產(chǎn)量產(chǎn)生影響，針對每個因素進行分析時，都可以找到各自最適的濃度。但是采用多因素聯(lián)合優(yōu)化的正交試驗設計，借助合適的正交表，可以充分考慮各因素間的交互作用，通過極差分析確定松阿扁葉蜂ＳＳＲ－ＰＣＲ最優(yōu)的反應體系為２５ μＬ體系中含１.00 Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２５．００ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ模板和１０．００ μｍｏｌ／Ｌ引物。此條件下獲得的條帶清晰，且重復率高。利用這個體系已成功地進行了松阿扁葉蜂幾個種群的遺傳多樣性分析，希望該研究結(jié)果也能為其他昆蟲包括葉蜂其他種類的ＳＳＲ－ＰＣＲ研究提供參考。

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收稿日期：２０１２－０１－１０

基金項目：西北農(nóng)林科技大學重大項目培育專項（ＰＹ２００９０３）

作者簡介：金娜（１９８６－），女，甘肅白銀人，碩士，主要從事森林昆蟲學方面的研究工作，（電話）１５２４９２２２３３７（電子信箱）ｊｉｎｎａ２０１１１＠１６３．ｃｏｍ；

通訊作者，賀虹，副教授，（電話）１３５７２５７６８１２（電子信箱）ｈｅｈｏｎｇｏｋ＠１２６．ｃｏｍ。