楊強(qiáng) 劉金龍 鄭小江 陳瑤

摘要：目前市場(chǎng)上生產(chǎn)的蛹蟲草產(chǎn)品沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，影響市場(chǎng)對(duì)蛹蟲草產(chǎn)品的消費(fèi)，研究結(jié)果表明，蛹蟲草菌種Ｈｚ１孢子復(fù)壯的菌株培養(yǎng)的子實(shí)體干重高于菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子復(fù)壯的菌株培養(yǎng)的子實(shí)體干重，其液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生產(chǎn)富硒蛹蟲草培養(yǎng)基的最優(yōu)主料為富硒大米４５ ｇ、培養(yǎng)液５５ ｍＬ，在培養(yǎng)溫度為２２ ℃、空氣相對(duì)濕度70％時(shí)蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)最好。綜合而言，子實(shí)體培養(yǎng)最優(yōu)條件為日間溫度２2 ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對(duì)濕度７０％、光照度２００ ｌｘ，并結(jié)合先用日光燈照射、待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射處理的產(chǎn)量最高。檢測(cè)結(jié)果顯示，蛹蟲草子實(shí)體的有效成分含量分別為硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白質(zhì)２７．７４％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、蟲草素２．６１％、氨基酸２６．９２％，尤其是所含的蟲草素具有工業(yè)提取價(jià)值。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；質(zhì)量；產(chǎn)量；技術(shù)參數(shù)；優(yōu)化；生產(chǎn)技術(shù)

中圖分類號(hào)：Ｓ５６７．３＋５；Ｑ９３－３；Ｑ９３９．９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－4069-07

Integrated Production Technology for Improving the Quality and Yield of

Cordyceps militaris

ＹＡＮＧ Ｑａｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙａｏ

(School of Biological Science and Technology/Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, Hubei, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ａｎｙ ｕｎｉｆｏｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ ｉｎ ｍａｒｋｅｔ， ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｕｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｏｄｓ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｒｕｉｔ ｂｏｄｙ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ Ｈｚ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｂ１， Ｂｚ１， Ｈ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ 2０ ｇ／Ｌ， ｐｅｐｔｏｎｅ 8 ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍａｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｃ． ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｏｒｎ ４５ ｇ ＋ ｍｅｄｉｕｍ ５５ ｍＬ． Ｔｈｅ ｆａｓｔｅｓｔ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ２２ ℃， ａｎｄ 70％ ｈｕｍｉｄｉｔｙ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ２2 ℃ ａｔ ｄａｙｔｉｍｅ ａｎｄ １５ ℃ ａｔ ｎｉｇｈｔ， ｈｕｍｉｄｉｔｙ ７０％， illuminance ２００ ｌｘ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｕｅ－ｖｉｏｌｅｔ ｒａｙｓ ｗｈｅｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ １～２ ｃｍ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ， ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ ５２．０３ ｍｇ／ｋｇ， ２７．７４％， ０．０５％， ２．５０％， ２．６１％ ａｎｄ ２６．９２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｖａｌｕｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ； ｑｕａｌｉｔｙ； ｙｉｅｌｄ； ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

蛹蟲草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ］又稱為北冬蟲夏草，屬真菌界的子囊菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）肉座菌目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）麥角菌科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）蟲草屬［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｆｒ．）Ｌｉｎｋ］ 真菌，與冬蟲夏草［Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ （Ｂｅｒｋ．） Ｓａｃｃ．］為同屬異種真菌［１］，是蟲草屬的模式種；在我國(guó)的吉林、四川、河北、湖南、湖北、山西等省均有生長(zhǎng)，美國(guó)、加拿大、意大利、日本、德國(guó)、俄羅斯等國(guó)也有分布，但在自然界的分布與產(chǎn)量遠(yuǎn)比冬蟲夏草稀少。蛹蟲草藥性作用溫和，長(zhǎng)期以來就是既可藥用又可食用的高級(jí)滋補(bǔ)品，并且一年四季皆可服用，對(duì)老、少、病、弱、虛者皆宜，無任何副作用［2］，市場(chǎng)潛力巨大。但由于野生蛹蟲草數(shù)量極少，不能滿足市場(chǎng)的需求，即使價(jià)格昂貴也供不應(yīng)求，所以人們采用科學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了人工培植［3－６］，也取得了成功。但人工培養(yǎng)的蛹蟲草尤其是富硒蛹蟲草，其藥用成分的含量高低不一，這對(duì)蛹蟲草的藥性發(fā)揮、滋補(bǔ)功效穩(wěn)定性、市場(chǎng)信譽(yù)產(chǎn)生了不良影響，反映出生產(chǎn)企業(yè)不僅沒有形成蛹蟲草人工生產(chǎn)質(zhì)量化標(biāo)準(zhǔn)，而且無統(tǒng)一規(guī)范化的生產(chǎn)工藝流程［７－１０］。針對(duì)蛹蟲草生產(chǎn)工藝流程中影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的主要問題，我們開展了系統(tǒng)研究，初步建立了蛹蟲草高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)流程，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種參試的蛹蟲草菌種有４個(gè)，分別是Ｂ１（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），Ｈ１（購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物研究所），Ｂｚ１（購(gòu)于湖北民族學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室），Ｈｚ１（購(gòu)于恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）。菌種回來后都進(jìn)行了孢子復(fù)壯［11］，成為各自的系列菌種。天然冬蟲夏草子實(shí)體購(gòu)自當(dāng)?shù)氐耐侍盟幍辍?/p>

１．１．２培養(yǎng)基及培養(yǎng)主料原料基礎(chǔ)培養(yǎng)基為ＰＤＡ培養(yǎng)基（不含瓊脂），試驗(yàn)原料有葡萄糖、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＳｅＯ３（以上為化學(xué)純）和維生素Ｂ１（ＶＢ１，醫(yī)用）、天然硒濃縮水（生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制）；生長(zhǎng)培養(yǎng)的主料原料為從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買的恩施出產(chǎn)的含硒２．７ ｍｇ／ｋｇ的大米（恩施清水橋米）以及馬鈴薯、燕麥、蕎麥、稻谷，此外還有珍珠巖。

１．１．３儀器參試的儀器為生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室原已置備的ＬＲＨ－ＺＳＯ恒溫培養(yǎng)箱、ＤＸ－Ⅱ磁力攪拌器、ＢＴ２５Ｓ電子天平、８０－２離心機(jī)、ＰＨＳ－２５ ｐＨ計(jì)、ＬＣ－１０ ＡＴｕｐｐｌｕｓ液相色譜儀、示差析光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、ＹＸＱＳＧ４６２８０手提式壓力蒸汽滅菌器、ＩＯＰ－Ⅲ無菌操作臺(tái)、格力ＫＦＲ－ＳＮ５空調(diào)、ＷＳ２０２０Ａ２溫濕度儀、烘箱、ＧＸＭＱ系列滅菌器、ＣＯ２探測(cè)儀、安捷倫HP1100氨基酸自動(dòng)分析儀、鼓風(fēng)機(jī)、接種儀器、移液槍、改裝電動(dòng)穿孔裝置、改裝注水槍、酒精燈等，以及三角瓶、廣口玻璃瓶、聚乙烯封口塑料薄膜、耐高溫橡皮筋等耗材。

１．２方法

１．２．１碳源對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ配制：?。玻埃?ｇ馬鈴薯去皮切成薄片，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，用紗布過濾，取上清液，加入葡萄糖２０ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ、維生素Ｂ１微量［12］。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ中的２０ ｇ葡萄糖成分分別換成２０ ｇ麥芽糖、１５ ｇ蔗糖、２０ ｇ可溶性淀粉，配制成３種新碳源液體培養(yǎng)基，加上基礎(chǔ)培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ，一共是４種碳源液體培養(yǎng)基。取500 ｍＬ三角瓶若干個(gè)，每個(gè)三角瓶分別裝入２５０ ｍＬ 的４種碳源液體培養(yǎng)基，用封口膜封口滅菌，分別接種蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個(gè)菌種，接種量都為２５ ｍＬ，各菌種不同碳源培養(yǎng)基的處理都接５瓶，在２２ ℃、磁力攪拌器轉(zhuǎn)速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察各菌種在不同碳源培養(yǎng)基里的生長(zhǎng)情況。７２ ｈ后過濾菌絲體，用去離子水洗滌５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷卻后測(cè)定各菌種菌絲體干重［3］。

１．２．２氮源對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ中的１０ ｇ蛋白胨成分分別換成５ ｇ酵母粉、５０ ｇ麥麩、３０ ｇ尿素、２０ ｇ黃豆粉，配制成４種新氮源液體培養(yǎng)基，加上基礎(chǔ)培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ，一共是５種氮源液體培養(yǎng)基。同樣用500 ｍＬ三角瓶分別裝入２５０ ｍＬ 的５種氮源液體培養(yǎng)基，封口膜封口滅菌后分別接種蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個(gè)菌種，接種量也是２５ ｍＬ，各菌種不同氮源培養(yǎng)基的處理都接５瓶，在２２ ℃、磁力攪拌器轉(zhuǎn)速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察各菌種在不同氮源培養(yǎng)基里的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)結(jié)束后過濾菌絲體，用去離子水洗滌５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷卻后測(cè)定各菌種菌絲體干重［３］。

１．２．３液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４作為４個(gè)因素，各因素均?。硞€(gè)水平，其他成分不變，設(shè)計(jì)了一個(gè)Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)［13］，蛹蟲草菌種為Ｈｚ１，詳情見表１。試驗(yàn)接種量為２５ ｍＬ，在磁力攪拌器轉(zhuǎn)速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、２２ ℃條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察Ｈｚ１菌絲生長(zhǎng)情況，測(cè)定菌絲體干重，方式同上。

１．２．４最優(yōu)培養(yǎng)主料比較試驗(yàn)菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別有大米培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、蕎麥培養(yǎng)基、萌發(fā)稻谷培養(yǎng)基、萌發(fā)蕎麥培養(yǎng)基、珍珠巖+米粉混合物培養(yǎng)基，各生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料的用量都為４５ ｇ，只是珍珠巖+米粉混合物培養(yǎng)基中的珍珠巖用量分別有３個(gè)，具體見表２。所有生長(zhǎng)培養(yǎng)基都分別加入１．２．３得到的最佳液體培養(yǎng)液組合４５、５５、６５ ｍＬ；使用的蛹蟲草菌種為Ｈｚ１，接種量２５ ｍＬ，自然光照，溫度２２ ℃，培養(yǎng)５０ ｄ后測(cè)定所得子實(shí)體的干重［14］。

１．２．５蛹蟲草孢子復(fù)壯培養(yǎng)用滅菌手術(shù)解剖刀分別在蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個(gè)菌種成熟的孢子部位劃一切口，取滅菌短鑷子輕輕地碰擊數(shù)次，用裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（平皿）接住，使蛹蟲草孢子接種于培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基中，移至恒溫培養(yǎng)箱中２２ ℃復(fù)壯［15］培養(yǎng)２４ ｈ，觀察其菌落特征。隨后將以上一級(jí)菌種接種到最優(yōu)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)７２ ｈ，培養(yǎng)條件為２２ ℃、，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ。將二級(jí)菌種接種到最優(yōu)人工栽培培養(yǎng)基中，每組平行５０瓶，記錄轉(zhuǎn)色時(shí)間、子實(shí)體形態(tài)、子實(shí)體干重。

１．２．６培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌控制設(shè)計(jì)及接種器具比較提前１ ｄ將生產(chǎn)所需數(shù)量的廣口玻璃瓶（８００ ｍＬ）進(jìn)行二次清洗，分裝排列整齊。由制種室提供液體培養(yǎng)基所需的配料量，由灌裝室進(jìn)行配料操作，每批生產(chǎn)３ ０２４瓶。滅菌流程為滅菌溫度１００ ℃、滅菌方式有高壓滅菌（３０、４５ ｍｉｎ）和間歇滅菌（３０ ｍｉｎ＋３０ ｍｉｎ）；滅菌完成后進(jìn)行蛹蟲草接種。接種室在紫外滅菌１ ｈ后再等待５ ｍｉｎ才能進(jìn)入接種室；接種前工作人員要用７５％的乙醇噴灑工作服，用脫脂棉蘸?。罚担サ囊掖疾潦秒p手，并檢測(cè)所有待裝瓶，觀察有無破痕、薄膜有無脫落等狀況［１６，１７］，及時(shí)處理分裝并標(biāo)記、記錄。隨后用移液槍、改裝后的接種器分別進(jìn)行接種，接種量１０％，接種速率有１０瓶／ｍｉｎ、２０瓶／ｍｉｎ；菌種選用Ｈｚ１，觀察記錄菌絲、子實(shí)體生長(zhǎng)狀態(tài)，最后統(tǒng)計(jì)Ｈｚ１菌種子實(shí)體的系統(tǒng)污染率。

１．２．７溫度、空氣相對(duì)濕度對(duì)蛹蟲草４個(gè)菌種子實(shí)體培養(yǎng)管理參數(shù)研究設(shè)計(jì)對(duì)溫度、空氣相對(duì)濕度、蛹蟲草菌種進(jìn)行單因素試驗(yàn)［18］，溫度設(shè)置１５、１８、２０、２２、２４ ℃ ５個(gè)水平；空氣相對(duì)濕度設(shè)置６０％、６５％、７０％、７５％、８０％ ５個(gè)水平；４個(gè)蛹蟲草菌種為Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１。從單因素試驗(yàn)結(jié)果中各篩選出２個(gè)最優(yōu)的水平進(jìn)行３因素的Ｌ４（２３）正交試驗(yàn)（表３），以篩選最適合蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件［19］。

１．２．８溫度、空氣相對(duì)濕度、光照度影響蛹蟲草Ｈｚ１菌種的子實(shí)體產(chǎn)量正交設(shè)計(jì)選取白天溫度、夜間溫度、空氣相對(duì)濕度、光照度４個(gè)因素，設(shè)置３水平的Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)，因素與水平組合情況見表４，以篩選最適合蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。

１．２．９不同光源對(duì)蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實(shí)體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響選取3５０瓶接種了蛹蟲草Ｈｚ１菌種的裝瓶，分別進(jìn)行不同光源的處理： ①日光燈單獨(dú)照射；②紅燈單獨(dú)照射；③藍(lán)紫燈單獨(dú)照射；④先用紅燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射；⑤先用藍(lán)紫燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用紅燈照射；⑥先用日光燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射；⑦先用日光燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用紅燈照射。每處理50瓶，處理后分別進(jìn)行子實(shí)體生長(zhǎng)描述，并測(cè)定子實(shí)體干重［20］。

１．２．１０蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實(shí)體成分檢測(cè)蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實(shí)體的硒含量及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量采用原子吸收法檢測(cè)［9］；氨基酸種類和含量采用安捷倫ＨＰ１１００氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定［11］；腺苷含量采用ＡＴＰ法檢測(cè)［5］；多糖含量采用硫酸苯酚法檢測(cè)［21］。蟲草素含量采用高效液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器串聯(lián)的方法測(cè)定［5］。

２結(jié)果與分析

２．１蛹蟲草各菌種在不同碳源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長(zhǎng)情況

蛹蟲草各菌種在不同碳源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長(zhǎng)情況見表５。從表５可見，Ｂ１菌種生長(zhǎng)最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｂｚ１菌種生長(zhǎng)最適的碳源為１５ ｇ／Ｌ蔗糖，Ｈ１菌種生長(zhǎng)最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｈｚ１菌種生長(zhǎng)最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖。４個(gè)菌種中，Ｈｚ１菌種的最高菌絲生長(zhǎng)量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１最高菌絲生長(zhǎng)量高出了4．5％、２０．９％、３２.0％。

２．２蛹蟲草各菌種在不同氮源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長(zhǎng)情況

蛹蟲草各菌種在不同氮源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長(zhǎng)情況見表６。從表６可見，Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１菌種生長(zhǎng)最適的氮源均為１０ ｇ／Ｌ蛋白胨。４個(gè)菌種中Ｈｚ１菌種的菌絲生長(zhǎng)量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌種的最高菌絲生長(zhǎng)量高出了６．１％、２２．５％、３０．８％。

２．３蛹蟲草菌種Ｈｚ１液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

蛹蟲草菌種Ｈｚ１液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)結(jié)果見表７。從表７可見，在４個(gè)試驗(yàn)因素中，影響菌絲量高低的順序?yàn)椋海粒荆拢荆模荆?；最?yōu)組合為Ａ2Ｂ1Ｃ２Ｄ２。即葡萄糖2０ ｇ／Ｌ，蛋白胨8 ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ 1.0 ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。

２．４蛹蟲草菌種Ｈｚ１子實(shí)體培養(yǎng)基最優(yōu)主料與培養(yǎng)液比較

６個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料對(duì)蛹蟲草菌種Ｈｚ１子實(shí)體產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖１。從圖１可見，生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為大米４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量最高，達(dá)到了５．３２ ｇ／瓶，并表現(xiàn)出培養(yǎng)液偏少時(shí)其減產(chǎn)不明顯、但培養(yǎng)液偏多時(shí)減產(chǎn)顯著的現(xiàn)象，穩(wěn)產(chǎn)性算是最好的；生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為燕麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為５．２６ ｇ／瓶，但培養(yǎng)液減少、增多都嚴(yán)重減產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)性差；生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為蕎麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為６５ ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量并列最高，達(dá)到５．３２ ｇ／瓶，但隨著培養(yǎng)液減少出現(xiàn)大幅度減產(chǎn)；生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為萌發(fā)蕎麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為4５ ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為２．５０ ｇ／瓶，產(chǎn)量太低，無應(yīng)用價(jià)值；生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為萌發(fā)稻谷４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為４．００ ｇ／瓶，也無應(yīng)用價(jià)值；生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料為珍珠巖+米粉混合物４５ｇ、培養(yǎng)液為４５ｍＬ時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量?jī)H為１．０２ ｇ／瓶，在６個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基主料中產(chǎn)量最低。

２．５４個(gè)蛹蟲草菌種孢子復(fù)壯培養(yǎng)結(jié)果

蛹蟲草４個(gè)菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１成熟的孢子復(fù)壯培養(yǎng)結(jié)果見表８。從表８可見，用Ｈｚ１菌種孢子復(fù)壯培養(yǎng)得到的子實(shí)體不僅外形好看，而且每瓶產(chǎn)量比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌種孢子復(fù)壯培養(yǎng)得到的子實(shí)體產(chǎn)量依次高３．２％、２３．８％、９４．０％。反映出Ｈｚ１是４個(gè)蛹蟲草菌種子實(shí)體產(chǎn)量表現(xiàn)最好的菌種。

２．６Ｈｚ１菌種培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌效果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌控制比較結(jié)果見表９。從表９可見，１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ后冷卻、然后再用１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ的間歇滅菌方式效果最好，系統(tǒng)污染率僅為０．０８％；其次是１００ ℃滅菌４５ ｍｉｎ的高壓滅菌方式，系統(tǒng)污染率為０．１０％；而１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ的高壓滅菌方式系統(tǒng)污染率最高，達(dá)到了０．２０％。

２．７不同接種器具對(duì)Ｈｚ１蛹蟲草菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

移液槍、改裝后的接種器對(duì)Ｈｚ１菌種子實(shí)體生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表１０。從表１０可見，改裝的接種器接種后，Ｈｚ１菌種的菌絲生長(zhǎng)分布均勻，子實(shí)體形態(tài)美觀，整體品質(zhì)較好；而移液槍接種后Ｈｚ１菌種的菌絲生長(zhǎng)分布不均勻，子實(shí)體形態(tài)不一致，整體品質(zhì)較差。改裝的接種器接種速度可達(dá)２０瓶／ｍｉｎ，比常規(guī)接種速度提高１倍，而且不增加系統(tǒng)污染率。

２．８溫度、空氣相對(duì)濕度對(duì)４個(gè)菌種子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)４個(gè)菌種子實(shí)體干重均值的影響結(jié)果見圖２。從圖２可見，培養(yǎng)溫度在２２ ℃時(shí)，４個(gè)菌種子實(shí)體干重的均值最大?？諝庀鄬?duì)濕度對(duì)４個(gè)菌種子實(shí)體干重均值的影響結(jié)果見圖３。從圖３可見，空氣相對(duì)濕度在７０％時(shí)，４個(gè)菌種子實(shí)體干重的均值最大。在４個(gè)菌種子實(shí)體干重方面，Ｈｚ１菌種子實(shí)體的干重最重，為４．８８ ｇ／瓶；Ｂｚ１菌種子實(shí)體的干重次之，為４．５０ ｇ／瓶；Ｂ１菌種子實(shí)體的干重為３．４２ ｇ／瓶；Ｈ１菌種子實(shí)體的干重為３．３２ ｇ／瓶。適合蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)的Ｌ４（２３）正交試驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)果見表１１。從表１１可見，影響蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量高低的因素排序?yàn)椋茫荆粒荆?，最佳組合為Ａ２Ｂ2Ｃ２，即溫度為２２ ℃、空氣相對(duì)濕度為70％、菌種選?。龋睍r(shí)，子實(shí)體平均干重最重。

２．９溫度、空氣相對(duì)濕度、光照度影響Ｈｚ１菌種的子實(shí)體產(chǎn)量Ｌ９（３４）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

蛹蟲草菌種Ｈｚ１的子實(shí)體培養(yǎng)條件Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)結(jié)果見表１２。從表１２可見，影響蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量高低的因素排序?yàn)闉椋粒荆模荆茫荆?，最佳組合為Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實(shí)體最優(yōu)培養(yǎng)條件為白天溫度２２ ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對(duì)濕度７０％、光照度２００ ｌｘ。

２．１０不同光源處理對(duì)蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

不同光源對(duì)Ｈｚ１菌種子實(shí)體產(chǎn)量的影響結(jié)果表明，處理⑥（先用日光燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為５．３０ ｇ／瓶；處理⑦（先用日光燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用紅燈照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為５．２８ ｇ／瓶；處理⑤（先用藍(lán)紫燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用紅燈照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為５．２２ ｇ／瓶；處理④（先用紅燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為５．０４ ｇ／瓶；而處理③（藍(lán)紫燈單獨(dú)照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為４．７６ ｇ／瓶；處理②（紅燈單獨(dú)照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為４．４８ ｇ／瓶；處理①（日光燈單獨(dú)照射）的蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量?jī)H為３．２６ ｇ／瓶。說明先用日光燈照射，待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射處理的子實(shí)體產(chǎn)量最高，效果最好。

２．１１蛹蟲草Ｈｚ１菌種和冬蟲夏草子實(shí)體的氨基酸含量比較結(jié)果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實(shí)體在氨基酸含量方面的測(cè)定結(jié)果見表１３。從表１３可見，在人體必需氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）含量［22，23］方面，蛹蟲草Ｈｚ１菌種除賴氨酸、色氨酸含量分別比天然冬蟲夏草的低１８．２%、３．３%之外，苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量依次比天然冬蟲夏草的提高１２９．５％、１２０．９％、７３．３％、４３．８％、３８．４％、１１．１％。在人體半必需氨基酸（精氨酸、組氨酸）含量方面，蛹蟲草Ｈｚ１子實(shí)體的精氨酸、組氨酸含量分別比天然冬蟲夏草的低２８．７%、２０．０%。不過在總氨基酸含量［22］方面，蛹蟲草的總氨基酸含量比天然冬蟲夏草的總氨基酸含量高２４．８％，說明蛹蟲草的營(yíng)養(yǎng)成分不亞于天然冬蟲夏草的。

２．１２蛹蟲草Ｈｚ１菌種和冬蟲夏草子實(shí)體的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素比較結(jié)果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實(shí)體在礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量方面的測(cè)定結(jié)果見表１４。從表１４可見，蛹蟲草微量元素含量與天然冬蟲夏草相比，Ｓｅ含量提高了８６８．９％，Ｍｎ含量提高了５３．３％；但Ｎｉ含量降低了７０．４%，Ｃｕ含量降低了５９．１%，Ｚｎ含量降低了６５．８%，Ｆｅ含量降低了６１．２%。蛹蟲草大量元素含量與天然冬蟲夏草相比，Ｋ含量提高了４１４．７％，但Ｃａ含量降低了６０．３%。檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究培養(yǎng)的蛹蟲草屬于富硒類型，這對(duì)于功能性食品的開發(fā)具有重要價(jià)值［24，25］；并且Ｃｕ是重金屬，Ｃｕ含量降低有利于人體健康［26］；而Ｎｉ是對(duì)健康有益的微量元素［27］，Ｎｉ偏低，說明將其進(jìn)一步提高到天然冬蟲夏草含量的水平還需要做許多工作。

２．１３蛹蟲草Ｈｚ１菌種其他成分含量

蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實(shí)體其他成分含量測(cè)定結(jié)果為蛋白質(zhì)２７．７４％、多糖２．５０％、腺苷０．０５％、蟲草素２．６１％，。而天然冬蟲夏草的蟲草素含量為０．０１％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本研究培養(yǎng)的蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實(shí)體的蟲草素含量。

３小結(jié)與討論

試驗(yàn)對(duì)蛹蟲草生產(chǎn)工藝流程中影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的主要問題進(jìn)行了探討，初步建立了蛹蟲草高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)流程。結(jié)果顯示，蛹蟲草菌種Ｈｚ１孢子復(fù)壯的菌株培養(yǎng)的子實(shí)體干重高于菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子復(fù)壯的菌株培養(yǎng)的子實(shí)體干重，液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生產(chǎn)富硒蛹蟲草培養(yǎng)基的最優(yōu)主料為富硒大米４５ ｇ、培養(yǎng)液５５ ｍＬ；在菌種培養(yǎng)環(huán)境為最適溫度２２ ℃、空氣相對(duì)濕度70％時(shí)，蛹蟲草菌種Ｈｚ１的子實(shí)體平均干重最大。綜合而言，子實(shí)體培養(yǎng)最優(yōu)條件為日間溫度２2 ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對(duì)濕度７０％、光照度２００ ｌｘ，并結(jié)合先用日光燈照射、待子實(shí)體長(zhǎng)至１～２ ｃｍ時(shí)使用藍(lán)紫燈照射處理的產(chǎn)量最高。檢測(cè)結(jié)果顯示，用本研究技術(shù)生產(chǎn)出來的蛹蟲草子實(shí)體的有效營(yíng)養(yǎng)成分含量分別為硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白質(zhì)２７．７４％、氨基酸２６．９２％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、蟲草素２．６１％。這些參數(shù)對(duì)優(yōu)化蛹蟲草生產(chǎn)工藝和建立產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)體系具有重要參考價(jià)值。而且主要有效成分和營(yíng)養(yǎng)成分要高于天然冬蟲夏草，尤其是所含的蟲草素具有工業(yè)提取價(jià)值［28］，證明應(yīng)用本研究技術(shù)生產(chǎn)出來的蛹蟲草產(chǎn)量高、質(zhì)量好，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。但在蛹蟲草的腺苷、賴氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸以及Ｎｉ含量上有待進(jìn)一步研究提高。

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收稿日期：２０１１－０８－２８

基金項(xiàng)目：湖北民族學(xué)院高校產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（ｃｘｙ２００９Ｂ０３７）；湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院２０１１大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（ＳＫＹ２０１１４９）

作者簡(jiǎn)介：楊強(qiáng)（１９８９－），男，湖北宜昌人，２００７級(jí)本科生，（電話）１５０７１８４６６４２（電子信箱）４１１０９３４５０＠ｑｑ．ｃｏｍ；通訊作者，劉金龍，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，

主要從事野生動(dòng)植物保護(hù)與利用研究工作，（電話）１３４０２７３３８１８（電子信箱）ｌｉｕｊｌ１６１８＠１６３．ｃｏｍ。