Nguyen Thi Thanh Van 陳勁楓

摘 要： 以卡羅爾、HH1-8-57與津綠農(nóng)家樂3個不同基因型黃瓜品種為試材，在Kumar 等、Song 等和詹艷等試驗研究基礎(chǔ)上，設(shè)計試驗分別探討低溫預(yù)處理時間、培養(yǎng)基成分（胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基）和基因型等因素對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：在4 ℃ 低溫預(yù)處理2 d時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于其他處理；在MS■1.0 mg·L-1 2，4-D ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 3% 蔗糖 ■ 0.8% 瓊脂培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達到81.3%；在MS ■ 0.1 mg·L-1 NAA ■ 3.0 mg·L-1 6-BA ■ 3% 蔗糖 ■ 0.8% 瓊脂培養(yǎng)基上胚狀體誘導(dǎo)率最高，為40.0%；基因型間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率及胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著，津綠農(nóng)家樂品種胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達到81.1%，HH1-8-57胚狀體誘導(dǎo)率最高，為40.0%。本研究從2份試材中成功地誘導(dǎo)出胚狀體并獲得了黃瓜單倍體再生植株。

關(guān)鍵詞： 黃瓜； 花藥培養(yǎng)； 胚性愈傷組織； 胚狀體； 再生植株

Cucumber （Cucumis sativus L.） Anther Culture

Nguyen Thi Thanh Van， CHEN Jin-feng

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu， 210095， China）

Abstract： Based on the protocols by Kumar et al，Song et al and Zhan，the anthers of three cucumbers genotypes“Kaluoer”，“HH1-8-57”and“Jinlu Nongjiale” were used as test materials to investigate the factors of anther pretreatment（temperature and duration），medium composition（embryonic callus induction medium and embryo induction medium） and cucumber genotype on cucumber anther culture. The results showed that pretreatment of anthers at 4 ℃ for 2 d significantly increased the embryonic callus induction ratio；the highest rate（81.3%）of embryonic callus induction was obtained on Zhans medium（MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar）；the highest rate（40.0%） of embryoids induction was obtained on Songs embryo induction medium（MS + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar）. The embryonic callus and embryoid induction ratios were significantly different among tested varieties. Variety“Jinlu Nongjiale” had the highest embryonic callus induction rate（81.1%）and“HH1-8-57”had the highest embryoid induction rate（40.0%）. Embryogenesis and haploid plants were obtained from two of three tested genotypes.

Key words： Cucumber； Anther culture； Embryonic callus； Embryoid； Plant regeneration

黃瓜（Cucumis sativus L.）是葫蘆科重要的經(jīng)濟作物。采用常規(guī)育種手段選育新品種不僅耗時耗力、效率低，且難以使新品種在抗性和品質(zhì)等方面有顯著提高。利用花藥培養(yǎng)技術(shù)可快速獲得純系和突變體，將大大縮短育種時間，同時也為分子理論研究提供基礎(chǔ)。

有關(guān)黃瓜花藥培養(yǎng)研究目前在國內(nèi)外報道較少。Lazarte和Sasser[1]首次從黃瓜花藥培養(yǎng)中獲得愈傷組織，但沒有說明愈傷組織的來源是配子體還是孢子體。Kumar等[2-3]以及詹艷[4]對幾個黃瓜品種進行花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)生并獲得了單倍體再生植株。Song等[5]通過黃瓜花藥培養(yǎng)獲得了雙單倍體。本文是在Kumar 等[2]、詹艷[4]和Song等[5]試驗研究的基礎(chǔ)上，從胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、4 ℃ 低溫預(yù)處理時間、胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基等方面設(shè)計試驗，研究其對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，確定最適宜的花藥培養(yǎng)條件，為建立黃瓜花藥培養(yǎng)及植株再生體系提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以卡羅爾、HH1-8-57與津綠農(nóng)家樂作為供體材料，將其種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站塑料大棚中，常規(guī)管理。

1.2 花藥培養(yǎng)方法

于盛花期，在晴天 9 : 00—10 : 00選擇健壯植株，取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾。將花蕾放置于鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿中，然后置于4 ℃下預(yù)處理2 d。接種前先將花蕾用流水沖洗30 s，然后用70% 酒精消毒30 s，再用0.1% 升汞消毒8 min，最后用無菌水沖洗3次，每次30~60 s?；ɡ傧局螅诔瑑艄ぷ髋_上，用鑷子和解剖針小心剝?nèi)』ɡ僦械?個花藥，去除花絲，接種到盛裝30 mL 固體胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（90 mm×15 mm）內(nèi)，然后置于25 ℃ 下暗培養(yǎng)2周產(chǎn)生胚性愈傷組織。再將其轉(zhuǎn)接至胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25 ℃ 恒溫條件下培養(yǎng)20 d左右，每天進行16 h光照培養(yǎng)，以獲得胚狀體。之后胚狀體在胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基（MS ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 6.0% 蔗糖 ■1.2% 瓊脂）上培養(yǎng)20 d左右，使其萌芽并形成苗。將無根苗以及根較弱的再生植株轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基（1/2 MS■0.2 mg·L-1 IBA■ 3% 蔗糖■ 0.8% 瓊脂）上進行光照培養(yǎng)，15 d左右即可獲得大量的根，形成完整的再生植株。

1.3 各因素對花藥培養(yǎng)的影響試驗

1.3.1 不同胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 每個參試材料取70個花蕾，4 ℃ 低溫預(yù)處理1 d。然后接種到不同胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1）上。接種密度為每個培養(yǎng)皿25個花藥，每種培養(yǎng)基接種3個培養(yǎng)皿，作為3次重復(fù)。暗培養(yǎng)2周以后，統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，要求分化出的胚性愈傷組織直徑在0.2 cm以上。公式如下：

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率/%=（產(chǎn)生胚性愈傷組織花藥數(shù)量/接種花藥數(shù)量）×100

表1 3種胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分

[注] （1）Kumar的培養(yǎng)基；（2）Song的培養(yǎng)基；（3）詹艷的培養(yǎng)基。表 2同。

1.3.2 4 ℃ 低溫預(yù)處理不同時間對黃瓜花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 每個參試材料取80個花蕾，隨機分作4組，分別于4 ℃ 下預(yù)處理0 d、1 d、2 d和4 d?；ɡ兕A(yù)處理完畢，基于試驗1的結(jié)果，將其接種到3號胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。接種密度為每個培養(yǎng)皿25個花藥，每個處理接種3個培養(yǎng)皿，作為3次重復(fù)。在暗室培養(yǎng)2周后，統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3.3 不同胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對胚狀體誘導(dǎo)的影響

將之前試驗獲得的胚性愈傷組織，接種到不同的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）上。每個培養(yǎng)皿接種 15塊胚性愈傷組織，每種培養(yǎng)基接種3個培養(yǎng)皿，作為3次重復(fù)。光照培養(yǎng)培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計胚狀體誘導(dǎo)率。

胚狀體誘導(dǎo)率/%=[（產(chǎn)生胚狀體的胚性愈傷組織數(shù)量/接種胚性愈傷總數(shù)量）× 100]

表2 3種胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分

1.3.4 不同基因型對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響 每個材料各取18個花蕾，基于之前試驗的結(jié)果進行培養(yǎng)成苗和形成完整的再生植株。統(tǒng)計每個基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、胚狀體誘導(dǎo)率。

以上試驗所需培養(yǎng)基均利用1 mol·L-1 HCl和1 mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.8，培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，溫度為（121±1）℃，滅菌時間 20 min。

1.4 再生植株倍性鑒定

將再生植株在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，從培養(yǎng)瓶中隨機選取20株，取根尖，參照李懋學(xué)等[6]的方法，稍作改動進行染色體計數(shù)：將根尖在室溫下先用0.075 mol·L-1的飽和對二氯苯處理3 h，然后用0.075 mol·L-1的KCl溶液處理30 min，最后在醋酸酒精（醋酸 ∶ 酒精=1 ∶ 3）溶液里固定24 h。用去離子水將處理好的根尖洗凈，而后在60 ℃下于1 mol·L-1 HCl中解離12 min，卡寶染色1 h，最后用45%乙酸壓片在OLYMPUS（BX51）顯微鏡下鏡檢。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS軟件統(tǒng)計分析相關(guān)數(shù)據(jù)，Duncans多重比較法進行顯著性測驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜花藥培養(yǎng)胚胎發(fā)生情況

黃瓜花藥在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS ■ 1.0 mg·L-1 2，4-D ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 3.0%蔗糖 ■ 0.8% 瓊脂）上生長1周后，有些花藥對誘導(dǎo)沒有反應(yīng)，很快褐化死亡，但有些花藥體積緩慢增大，并且顏色由剛接種時的黃色和黃綠色逐漸加深為深黃色和綠色（圖1-A）。之后愈傷組織不斷增殖，培養(yǎng)2周后，可見由彼此不相連且表面有很多突起的顆粒狀結(jié)構(gòu)組成的淡黃綠色胚性愈傷組織（圖1-B）。部分胚性愈傷組織已帶有球形胚（圖1-C）。胚狀體或帶有胚狀體的胚性愈傷組織不能在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進一步分化。因此將胚性愈傷組織（包括帶有胚狀體的胚性愈傷組織）轉(zhuǎn)接至胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂）上，培養(yǎng)20 d后可見成熟的子葉形胚（圖1-D）。之后將子葉形胚轉(zhuǎn)移至胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基（MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 6.0% 蔗糖 + 1.2% 瓊脂）上，培養(yǎng)20 d后，大部分子葉形胚可形成根、葉、芽俱全的完整植株，部分子葉形胚根發(fā)育不良形成無根苗（圖1-E1、E2），經(jīng)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)后生根（圖1-F）。

2.2 不同胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在植物花藥培養(yǎng)中誘導(dǎo)花粉細胞由配子體途徑轉(zhuǎn)化為孢子體途徑，形成體細胞胚胎的過程中，外源生長素和細胞分裂素是必不可少的誘導(dǎo)條件。如表3所示，3號胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性愈傷組織效果最佳，卡羅爾、HH1-8-57和津綠農(nóng)家樂的平均誘導(dǎo)率分別達到56.0%、73.7% 和77.3%。1號培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性愈傷組織效果最低，卡羅爾、HH1-8-57和津綠農(nóng)家樂的平均誘導(dǎo)率分別只有33.3%、40.0% 和42.7%。這表明在MS培養(yǎng)基中添加適量的 2，4-D和6-BA可以顯著提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

表3 3個黃瓜品種在3種胚性愈傷組織

誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率比較

[注] 1. 3號為詹艷的培養(yǎng)基：MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂。2. 同列不同小寫英文字母表示同個品種間差異顯著（P≤0.05），下同。

2.3 4 ℃ 低溫預(yù)處理不同時間對黃瓜花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

本試驗探討了4 ℃ 低溫預(yù)處理對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響（表4）。對供試的3份材料而言，在4 ℃ 低溫預(yù)處理2 d時，胚狀體誘導(dǎo)率顯著高于其他處理。這表明對本研究中的3份試材而言，4 ℃ 低溫預(yù)處理2 d時培養(yǎng)效果最好。同時也說明4 ℃ 低溫處理可作為花蕾的一種保存方式。

表4 不同低溫預(yù)處理時間3個黃瓜品種

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率比較

[注] 該試驗使用的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂。

2.4 不同胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對胚狀體誘導(dǎo)的影響

外源激素對黃瓜花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)成胚亦具有顯著影響。結(jié)果如表5所示，2號胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體效果最佳，HH1-8-57與津綠農(nóng)家樂平均誘導(dǎo)率分別達到40.0%、35.6% 。而卡羅爾在所有培養(yǎng)基胚狀體誘導(dǎo)率均為0。1號胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體效果最差，HH1-8-57與津綠農(nóng)家樂的平均誘導(dǎo)率分別只有17.8%、11.1% 。這說明在黃瓜花藥培養(yǎng)中，NAA與6-BA配合使用的比例有可能是成功誘導(dǎo)胚性愈傷組織分化的關(guān)鍵因素。

2.5 不同基因型對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響

如表6所示，基因型是影響黃瓜花藥培養(yǎng)的又一關(guān)鍵因素。不同基因型間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著，津綠農(nóng)家樂品種胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，HH1-8-57胚狀體誘導(dǎo)率最高，而卡羅爾則得不到胚狀體。

表6 不同基因型黃瓜花藥培養(yǎng)胚性

愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)率比較

2.6 黃瓜再生植株倍性鑒定

黃瓜染色體計數(shù)鑒定結(jié)果顯示，在隨機選取的20株再生植株中，HH1-8-57和津綠農(nóng)家樂分別有10株和3株是單倍體（圖2-A)，其余是二倍體（圖2-B）。

圖2 染色體計數(shù)情況

A. 單倍體，2 n=7；B. 二倍體，2 n=14

3 討 論

花藥培養(yǎng)中胚胎發(fā)生途徑可分為直接胚胎發(fā)生和間接胚胎發(fā)生。本研究中3份試材均發(fā)生了間接胚胎發(fā)生，主要經(jīng)歷了胚性愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體誘導(dǎo)和胚狀體萌發(fā)3個階段。其中又以前2個階段更為關(guān)鍵。胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、預(yù)處理、基因型對誘導(dǎo)胚性愈傷組織和胚狀體均具有顯著影響。

筆者研究了低溫預(yù)處理和基因型對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果顯示4 ℃ 低溫預(yù)處理2 d，胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳。溫度預(yù)處理能夠?qū)ㄋ幣囵B(yǎng)產(chǎn)生影響，有可能是因為溫度脅迫打亂了小孢子的早期細胞分裂，從而導(dǎo)致小孢子由正常形成花粉粒途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織發(fā)生途徑形成愈傷組織[7-8]。

本研究結(jié)果顯示詹艷的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS +1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0%蔗糖 + 0.8% 瓊脂配合使用）誘導(dǎo)效果最佳。Song的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂）誘導(dǎo)胚狀體效果最佳。這些結(jié)果表明在黃瓜花藥培養(yǎng)中的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加MS并與2，4-D和6-BA配合，能夠顯著提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。2，4-D已被廣泛應(yīng)用于各種作物花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)起始階段，它被認為對誘導(dǎo)小孢子脫分化形成愈傷組織有促進作用[7-9]。不同作物2，4-D的最佳用量不同。NAA與6-BA配合使用的比例有可能是成功誘導(dǎo)胚性愈傷組織分化的關(guān)鍵因素。總的來說，在黃瓜花藥培養(yǎng)中，誘導(dǎo)胚性愈傷組織是較易實現(xiàn)的，而誘導(dǎo)胚狀體則較難。

多種作物花藥培養(yǎng)研究表明，基因型是影響花藥培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素，花藥頑拗型材料可以通過與花培能力高的親本雜交，以改善其花培能力[10-12]。本試驗的3份材料都可以獲得胚性愈傷組織，但是只有2份材料能夠獲得胚狀體和再生植株。表明在黃瓜花藥培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)胚性愈傷組織成功分化形成胚有可能是很關(guān)鍵的限速步驟。

4 結(jié) 論

通過花藥培養(yǎng)可以獲得黃瓜單倍體再生植株。本研究篩選的用以黃瓜花藥的培養(yǎng)體系為：首先將處于單核靠邊期的花蕾置于4 ℃ 下預(yù)處理2 d，之后以MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂為胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂為胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 6.0% 蔗糖 + 1.2% 瓊脂為胚狀體萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以1/2 MS+0.2 mg·L-1 IBA+3% 蔗糖+0.8% 瓊脂為生根培養(yǎng)基。

參考文獻

[1] Lazarte J E， Sasser C C. Asexual embryogenesis plantlet development in anther culture of Cucumis sativus L.[J]. HortScience， 1982， 17： 88.

[2] Ashok Kumar H G， Murthy H N， Paek K Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther culture of Cucumis sativus L.[J]. Scienta Horticulturae， 2003， 98（3）： 213-222.

[3]Ashok Kumar H G， Murthy H N. Effect of sugars and amino acids on androgenesis of Cucumis sativus L. [J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2004， 78（3）： 201-208.

[4]詹艷. 黃瓜（Cucumis sativus L .）花藥培養(yǎng)與游離小袍子培養(yǎng)研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[5] Song H， Lou Q F， Luo X D， et al. Regeneration of doubled haploid plants by androgenesis of cucumber（Cucumissativus L.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2007，90（3）： 245-254.

[6]李懋學(xué)，杜美霞. 豌豆的核型研究[J]. 遺傳，1984，11（3）： 195-201.

[7]Ferrie A M R， Palmer C E， Keller W A. Haploid embryogenensis[M]. In：Thorpe TA（Ed）， In vitroembryogenensis in plants. Kuwer Academic Publishers. Dordercht， Netherlands 1995： 309-344.

[8]Toshikazu N， Yoshij N， Han D S. Haploid plant regeneration via embryogenesis from anther cultures of Hepatica nobilis[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2004， 79（3）： 307-313.

[9]Ball S T， Zhou H P， Konzak C F. Influence of 2，4-D， IAA， and duration of callus induction in anther culture ofspring wheat[J]. Plant Science， 1993， 90（2）： 195-200.

[10]Cai Q， Szarejko I， Polok K， et al. The effect of sugars and growth regulators on embryoid formation and plant regeneration[J]. Plant Breeding， 1992， 109（3）： 218-226.

[11]Metwally E I， Moustafa S A， Ei-Sawy B I， et al. Haploid plantlets derived by anther culture of Cucumbita pepo[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，1998，52（3）： 81-89.

[12] Malik M R， Rangaswamy N S， Shivanna K R. Induction of mi-crospore embryos in a CMS line of BrassicaJuncea and formation of the androgenic plantlets[J]. Euphytica， 2001， 120（2）： 195-203.

收稿日期： 2011-11-26

基金項目： “863”計劃專項（2010AA10A108，2012AA100202）； 江蘇省科技支撐計劃（BE2009310）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金[CX（11）1002]

作者簡介： Nguyen Thi Thanh Van，女，越南留學(xué)生，在讀碩士研究生，研究方向為植物組織培養(yǎng)。電子信箱： nguyenthanhvan132@yahoo.com.cn

通訊作者： 陳勁楓，男，教授，博導(dǎo)，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。電子信箱： jfchen@njau.edu.cn