岳怡涵　張健　廖鵬飛　李紹波

摘要：采用熒光定量ＰＣＲ方法分析了秈稻９３－１１根、莖、葉和花藥中ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)水稻不同組織ＯｓＤＣＬ３ｂ的表達(dá)量存在明顯差異，花藥中表達(dá)量最多，根中表達(dá)量最少。重點(diǎn)構(gòu)建了水稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化粳稻中花１１，獲得了轉(zhuǎn)基因Ｔ０代陽性植株，為進(jìn)一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ＯｓＤＣＬ３ｂ基因；組織表達(dá)；載體構(gòu)建；基因沉默；水稻

中圖分類號(hào)：Ｑ９４３．２ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5788-03

Ｄｉｃｅｒ或Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ（ＤＣＬ）蛋白通過產(chǎn)生ｓｉＲＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇＲＮＡ）和ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等小分子非編碼ＲＮＡｓ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ，ｎｃＲＮＡｓ）［１］來調(diào)控其他相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗蟲性和逆境適應(yīng)性等［２－４］。

在水稻中，已報(bào)道至少存在８?jìng)€(gè)可能的ＤＣＬ蛋白基因［５］。最初，Ｌｉｕ等［６，７］對(duì)ＯｓＤＣＬ１和ＯｓＤＣＬ４進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)ＯｓＤＣＬ１與ｍｉＲＮＡ的生物形成密切相關(guān)，缺失ＯｓＤＣＬ１的生物個(gè)體在幼苗期出現(xiàn)發(fā)育停滯現(xiàn)象，如植株矮化、葉片卷曲、根扭曲等現(xiàn)象。ＯｓＤＣＬ４主要影響大小為２１ｎｔ的ｓｉＲＮＡ的生物形成，與擬南芥同源基因ＡｔＤＣＬ４不同的是，沉默或缺失ＯｓＤＣＬ４既影響生物個(gè)體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，又影響生物個(gè)體的生殖生長(zhǎng)，而ＡｔＤＣＬ４僅影響生物個(gè)體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。隨后，Ｕｒａｙａｍａ等［８］的研究表明，敲除ＯｓＤＣＬ２的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源性ｄｓＲＮＡ病毒的含量水平將明顯降低，植株表現(xiàn)為矮化和育性降低等。Ｗｕ等［９］證實(shí)，ＯｓＤＣＬ３ａ與ｌｍｉＲＮＡ（ｌｏｎｇｍｉｃｒｏＲＮＡ）的產(chǎn)生密切相關(guān)。最近，Ｓｏｎｇ等［１０］進(jìn)一步報(bào)道了ＯｓＤＣＬ４、ＯｓＤＣＬ３ｂ和ＯｓＤＣＬ１的功能；其中ＯｓＤＣＬ３ｂ的功能為首次報(bào)道，報(bào)道中僅指出了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物學(xué)功能是加工產(chǎn)生大小為２４ｎｔ的?。遥危?，但這些小ＲＮＡ究竟調(diào)控哪些相關(guān)功能基因的表達(dá)，以及相關(guān)功能基因的表達(dá)變化又如何影響轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗蟲性或逆境適應(yīng)性等尚未見報(bào)道?；谠诙i稻９３－１１花藥中獲得的ＯｓＤＣＬ３ｂ的全長(zhǎng)ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號(hào)：ＤＱ２０８４０６），采用熒光定量ＰＣＲ方法研究了秈稻９３－１１不同組織部位ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表達(dá)差異，并利用ＲＮＡ干擾技術(shù)構(gòu)建了ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳稻中花１１，獲得了轉(zhuǎn)基因Ｔ０代陽性植株，為進(jìn)一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因加工產(chǎn)生的各種小分子ｎｃＲＮＡ究竟調(diào)控了哪些相關(guān)基因的表達(dá)、進(jìn)而影響轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗蟲性或逆境適應(yīng)性等打下了重要的基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料、菌種與質(zhì)粒 秈稻９３－１１和遺傳轉(zhuǎn)化所用材料粳稻中花１１種子均由南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院植物遺傳研究室保存。用于基因沉默的質(zhì)粒ｐＹＬ為改造的ＲＮＡｉ－Ｕｂｉ［１１］，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈(zèng)。大腸桿菌Ｔop１０Ｆ′、農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５由南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院植物遺傳研究室保存。

１．１．２ 主要試劑 ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰＣＲ反應(yīng)所用ＤＮＡ聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠ＤＮＡ回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物ＲＮＡ提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔ４ＤＮＡ連接酶、限制性內(nèi)切酶ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＭｌｕⅠ和ＰｓｔⅠ購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

１．２ 方法

１．２．１ 總ＲＮＡ的提取和正向干涉片段的ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增 按Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＴＲＩｚｏｌ試劑盒提取秈稻９３－１１花藥的總ＲＮＡ后，將其反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ，再用引物ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｓｉ：５′－ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧ－３′和ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｘｉ：５′－ＣＣＧＧＡＡＧ

２ 結(jié)果與分析

２．１ ＯｓＤＣＬ３ｂ在秈稻９３－１１根、莖、葉和花藥中的表達(dá)結(jié)果

２．２ 沉默載體的構(gòu)建結(jié)果

２．３ 轉(zhuǎn)基因Ｔ０代陽性植株的鑒定結(jié)果

３ 討論

前人的研究結(jié)果表明，粳稻ＯｓＤＣＬ３ｂ在營(yíng)養(yǎng)組織中往往低水平表達(dá)，在花器官和種子發(fā)育初期則高水平表達(dá)［５］。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，秈稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在秈稻９３-１１的花藥中表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量均較低，尤其是在根中的表達(dá)量幾乎只有花藥中的５０％。由此推測(cè)，ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在水稻花藥中高水平表達(dá)可能是水稻穗子的生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，但有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

最近，Ｓｏｎｇ等［１０］首次報(bào)道了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物學(xué)功能是加工產(chǎn)生２４ｎｔ的?。遥危粒?，這些小ＲＮＡ具體調(diào)控了哪些相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)哪些差異表型等尚未見報(bào)道。研究獲得的轉(zhuǎn)基因Ｔ０代陽性植株為進(jìn)一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了重要基礎(chǔ)。

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