申宏丹　王記蓮

摘要：采用碳化二亞胺－Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＥＤＣ－ＮＨＳ）法將萊克多巴胺（ＲＡＣ）與活化的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯(lián)，合成了免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法和紫外吸收法鑒定偶聯(lián)成功。用合成的免疫抗原免疫家兔獲得了高效價(jià)的多克隆抗體，采用所得抗體和辣根過氧化酶標(biāo)抗原建立萊克多巴胺直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA），標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型Ｓ型，具有良好的線性關(guān)系。

關(guān)鍵詞：萊克多巴胺；抗原；抗體；酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）

中圖分類號(hào)：Ｓ８５９．８４ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5736-03

萊克多巴胺屬于β２－興奮劑的一種，是一類結(jié)構(gòu)和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，它可以加快畜禽的生長(zhǎng)速度，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率。β２－興奮劑常見的有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等。隨著我國對(duì)鹽酸克倫特羅監(jiān)管力度的加大，鹽酸克倫特羅的非法應(yīng)用得到了有效的控制，萊克多巴胺作為其替代品，非法應(yīng)用日益猖獗。由于萊克多巴胺在動(dòng)物組織中殘留可能對(duì)人體產(chǎn)生很多不利影響，所以我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部和國家藥品監(jiān)督管理局明文禁止萊克多巴胺用于動(dòng)物養(yǎng)殖［１－４］。關(guān)于萊克多巴胺的檢測(cè)方法主要有儀器檢測(cè)和免疫檢測(cè)兩種，免疫檢測(cè)法主要包括酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法、免疫芯片法以及膠體金層析法［５，６］。質(zhì)量良好的抗原和抗體是免疫檢測(cè)法的基本和關(guān)鍵條件。該試驗(yàn)從改進(jìn)合成免疫抗原的條件入手，制備了萊克多巴胺多克隆抗體，為以后更好地開發(fā)對(duì)萊克多巴胺的免疫檢測(cè)方法做好了前期探索工作，對(duì)保障我國食品安全和醫(yī)療安全等具有十分重要的意義。

１ 材料

１．１ 試劑

萊克多巴胺（ＲＡＣ）；自制酶標(biāo)抗原（ＨＲＰ－ＲＡＣ）；琥珀酸酐；弗氏不完全和完全佐劑；吡啶；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）；卵清蛋白（ＯＶＡ）；甲醇；二氯甲烷；氨水；對(duì)乙基－Ｎ，Ｎ－二甲基丙基碳二亞胺（ＥＤＣ）；氮－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）；Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）；乙二胺（ＥＤＡ）；磷酸鹽緩沖液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）。

１．２ 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀（ＤＮＭ－９６０２型，北京普朗新技術(shù)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ＲＥ－５２Ａ型，上海亞榮生化儀器廠）；薄層層析板（GF2541型，青島海洋化工廠）；紫外－可見分光光度計(jì)（上海龍尼柯儀器有限公司）；紅外光譜儀（FTS-135型，鞏義市英山谷予華儀器廠）；真空冷凍干燥器（美國Bio-Rad公司）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海申勝生物科技有限公司）；離心機(jī)（ＴＧＬ－１６型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；電泳儀（ＤＹＹ－６Ｃ型，北京六一儀器廠）；電泳槽（ＤＹＣＥ－２４ＥＮ型，北京六一儀器廠）。

２ 方法

２．１ 牛血清白蛋白（ｃＢＳＡ－ＮＨ２）的活化

準(zhǔn)確稱?。玻罚恚纾牛模寥芙庥冢玻埃恚蹋校拢又?，用ＨＣｌ調(diào)節(jié)ｐＨ至７．４，制成Ａ液。依次稱?。保担纾拢樱?、８４ｍｇＥＤＣ溶解于２０ｍＬＰＢＳ中，制成Ｂ液。將Ｂ液緩慢加入到Ａ液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)２ｈ，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，４℃用ＰＢＳ透析３ｄ，４～６ｈ換一次透析液，透析完畢，用真空冷凍干燥機(jī)凍干，得到白色絮狀固體，－２０℃保存，備用。

２．２ 萊克多巴胺免疫抗原的制備與鑒定

采用改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法［７］合成免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），稱取３４ｍｇ鹽酸萊克多巴胺和１０ｍｇ琥珀酸酐溶解于２ｍＬ無水吡啶中，在磁力攪拌器下攪拌反應(yīng)至完全。反應(yīng)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，用三氯甲烷萃取除去未完全反應(yīng)的琥珀酸酐，得到純的萊克多巴胺半琥珀酸酐酯（ＲＡＣ－ＨＳ），真空冷凍干燥后得到干態(tài)的ＲＡＣ－ＨＳ。將ＲＡＣ－ＨＳ溶解于１ｍＬ１０％ＤＭＦ溶液中，分別加入一定量的ＥＤＣ和ＮＨＳ，室溫避光振蕩活化一段時(shí)間，加入β－巰基乙醇淬滅多余的ＥＤＣ。加入一定量活化的ＢＳＡ，室溫反應(yīng)一段時(shí)間后，加入鹽酸羥胺淬滅未反應(yīng)的ＮＨＳ，透析純化得到偶聯(lián)物。采用紫外全波長(zhǎng)掃描法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法對(duì)免疫抗原的偶聯(lián)比進(jìn)行鑒定。

２．３ 萊克多巴胺多克隆抗體的制備與直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的建立

初次免疫用注射器對(duì)抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按1∶1混合成油包水的乳濁液，每只兔注射０．５ｍｇ免疫原，背部皮下多點(diǎn)注射（５～１０點(diǎn)）。兩周后進(jìn)行二免采用弗氏不完全佐劑，劑量、方法同首免。以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，劑量減半。從第三次免疫開始，每次免疫７ｄ后，耳緣靜脈采血０．２ｍＬ，室溫凝固２ｈ后４℃過夜，１００００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，分離血清。檢測(cè)抗血清效價(jià)，陰性兔血清作為對(duì)照，當(dāng)抗血清效價(jià)基本不變時(shí)，不加佐劑只用生理鹽水進(jìn)行末次免疫，７ｄ后進(jìn)行頸動(dòng)脈采血。血液在４℃靜置過夜，１００００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，分離上清液，即抗血清?？寡宀捎昧蛩徜@鹽析法初步純化，初步獲得的抗血清再通過ＰｒｏｔｅｉｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ法繼續(xù)純化［８，９］，純化抗體冷凍干燥后－２０℃保存。用方陣法確定酶標(biāo)抗原ＲＡＣ－ＨＲＰ與多抗的最佳工作濃度，建立萊克多巴胺直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法，操作步驟見文獻(xiàn)［１０］。

３ 結(jié)果與分析

３．２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定免疫抗原結(jié)果

電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小，分子質(zhì)量越小的蛋白質(zhì)遷移越快。ＢＳＡ的泳動(dòng)速度大于ＲＡＣ－ＢＳＡ，說明ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子質(zhì)量大于ＢＳＡ，也可證明ＲＡＣ和ＢＳＡ已成功偶聯(lián)。用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件計(jì)算出ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子質(zhì)量為７．２４×１０４ｕ，ＢＳＡ的分子質(zhì)量為６．６３×１０４ｕ，計(jì)算得出ＢＳＡ與ＲＡＣ的偶聯(lián)比約為１∶２０，與紫外鑒定結(jié)果的偶聯(lián)比基本一致。

３．３ 方陣法確定抗體、酶標(biāo)物最佳工作濃度

采用常規(guī)直接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ法測(cè)定酶標(biāo)抗原和抗體的最佳工作濃度。用包被緩沖液將抗體從１０００～３２０００倍比稀釋，酶標(biāo)抗原從１０００～１６０００倍比稀釋，實(shí)驗(yàn)方法見直接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ反應(yīng)步驟。以ＯＤ４５０nm為１．０左右時(shí)的稀釋度為最佳值，則最佳抗體稀釋度為１∶８０００，最佳酶標(biāo)物稀釋度為１∶２０００，結(jié)果見表２。ＯＤ值≥陰性對(duì)照孔２倍判定為陽性，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)判定為抗體效價(jià)，測(cè)得抗體效價(jià)為１∶16０００，證明所合成的免疫抗原具有免疫活性并且能產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。

３．４ 直接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果

４ 小結(jié)與討論

１）ＲＡＣ是小分子物質(zhì)，只有反應(yīng)原性沒有免疫原性，必須和大分子載體偶聯(lián)后才能免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。該試驗(yàn)中使用的載體蛋白是牛血清白蛋白，先進(jìn)行活化，用乙二胺（ＥＤＡ）進(jìn)行封閉，使其只含有氨基，增加牛血清白蛋白和羧基反應(yīng)的活性，提高了偶聯(lián)效率。

２）在ＲＡＣ的仲胺位置成功地連接上琥珀酸酐，引進(jìn)羧基，可以采用多種常規(guī)的人工抗原偶聯(lián)方法。該試驗(yàn)中采用的是在ＥＤＣ基礎(chǔ)上改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法，即在ＥＤＣ基礎(chǔ)上，加入ＮＨＳ，可以控制蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，提高偶聯(lián)反應(yīng)的針對(duì)性，達(dá)到提高偶聯(lián)效率的目的。在合成過程中得到了固態(tài)的中間體ＲＡＣ－ＨＳ，為今后的科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供了很大的便利。

３）用合成的免疫抗原免疫大白兔獲得了１∶16０００高效價(jià)的多克隆抗體，建立了萊克多巴胺直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法，用方陣法確定抗體最佳稀釋度為１∶８000，酶標(biāo)抗原最佳稀釋度為１∶２０００。標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性，證明制備的免疫抗原和抗體可用，為繼續(xù)深入研究萊克多巴胺的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ＳＭＩＴＨＤＪ，ＳＨＥＬＶＥＲＷＬ．Ｔｉｓｓｕｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｒａｃｔｏｐｍａｉｎｅａｎｄｕｒｉｎａｒｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎａｎｉｍａｌｓｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ７ｄａｙｓｗｉｔｈdietaryｒａｃｔｏｐｍａｉｎｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳcｉｅｎｃｅ，２００２，８０（５）：１２４０－１２４９．

［２］ＲＯＳＳＫＡ，ＢＥＡＵＬＩＥＵＡＤ，ＭＥＲＲＩＬＬＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｒｏｌｅｏｎｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｌａｎｃｅａｎｄｗａｔｅｒｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｐｏｒｋｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１１，８９（７）：２２４３－２２５６．

［３］張宏偉，王 喆，劉 偉．動(dòng)物性食品中獸藥和飼料添加劑殘留及其對(duì)人體的危害［Ｊ］．獸藥與飼料添加劑，２００４，９（４）：１－３．

［４］張洪才，翁芝瑩，商 璟，等．動(dòng)物性產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［Ｊ］．食品科學(xué)，２０１１，３２（２１）：２５７－２６０．

［５］方耀國，張炳財(cái)，鄭志東，等．萊克多巴胺的檢測(cè)方法［Ｊ］．畜牧獸醫(yī)科技信息，２００９（５）：１２０－１２１．

［６］ＩＮＯＵＥＴ，ＣＨＡＮＧＪＰ．Ｃａｐｉｌｌｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｑｕｎａｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓｕｓｉｎｇｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓａｓｃｈｉｒａｌａｄｄｉｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｎｒａｌｏｆＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ&ＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００３，２６（１１）：１６７７－１６９３．

［７］金 晶．ＥＬＩＳＡ法和膠體金免疫層析法檢測(cè)豬尿樣中的萊克多巴胺［Ｄ］．南昌：南昌大學(xué)，２００７．

［８］于洪俠，楊曙明．萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定［Ｊ］．中國獸醫(yī)科技，２００５，３５（１２）：１０００－１００３．

［９］楊利國，胡永褪，魏平華，等．酶免疫測(cè)定技術(shù)［Ｍ］．南京：南京大學(xué)出版社，１９９８．２７９－２８３．

［１０］申宏丹，竇 紅，高春平，等．直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)萊克多巴胺的研究［Ｊ］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，２００９，３０（８）：５８－６３．

［１1］朱培坤．免疫酶技術(shù)原理和應(yīng)用［M］．濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，２００8．