李明波　張抗抗　宋忠旭　梅書棋

摘要：副豬嗜血桿菌病是流行于豬群的接觸性呼吸道傳染病，該病可以影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的各個(gè)階段，臨床上以豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為特征。對(duì)副豬嗜血桿菌病的臨床研究應(yīng)該包括菌株的分離鑒定、血清和基因分型、藥物和疫苗的防治研究等。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌??；菌株分離鑒定；分型；免疫及防治

中圖分類號(hào)：Ｓ８２８ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ｂ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5730-04

副豬嗜血桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）是正常豬群呼吸道上的一種常在菌。臨床上以豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、心包炎、腦膜炎為特征，該病又被稱為革拉澤氏?。郏保?。該病目前在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)感染率很高，且危害嚴(yán)重，主要引起哺乳仔豬、保育豬（３０～５０日齡）的關(guān)節(jié)腫脹、喘氣、進(jìn)行性消瘦、生長(zhǎng)速度變緩、急性或慢性死亡等。副豬嗜血桿菌病的臨床發(fā)病率一般在１０％～１５％，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)５０％，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。不同血清型菌株之間存在毒力差異。國(guó)外特別是養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)副豬嗜血桿菌做了流行病學(xué)調(diào)查，臨床發(fā)病豬中分離率高達(dá)２０％，且流行的血清型多為副豬嗜血桿菌中毒力較強(qiáng)的４、５、１３型等。蔡旭旺等［２］首次鑒定了副豬嗜血桿菌分離菌株的血清型，進(jìn)而建立了快速分離鑒定、培養(yǎng)和保存該菌的方法，并篩選出ＴＳＡ（胰蛋白大豆瓊脂）固體培養(yǎng)基和ＴＳＢ液體培養(yǎng)基作為最適合該菌的培養(yǎng)基。同時(shí)對(duì)２００４年１２月以前分離鑒定的２８１株副豬嗜血桿菌進(jìn)行了血清分型，表明中國(guó)目前流行的菌株是血清４型（２４．２％）和５型（１９．２％），其次是１３型（１２．５％）、１４型（７．１％）和１２型（６．８％），另有１２．１％的分離菌株不能進(jìn)行血清學(xué)分型。

副豬嗜血桿菌病是造成豬場(chǎng)保育豬死亡的主要原因，在特定條件下如斷奶、氣候應(yīng)激等因素才可侵入機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病。近年來(lái)，由于免疫抑制性疾病如藍(lán)耳?。ǎ校遥遥樱A環(huán)病毒２型（PCV-2）等的存在和持續(xù)性感染加劇了副豬嗜血桿菌的感染程度。

１ 病原學(xué)

１９１０年，Ｇｌａｓｓｅｒ首次報(bào)道了一種革蘭氏陰性短小桿菌與豬的纖維素性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎之間的聯(lián)系。１９２２年，Ｓｃｈｅｒｍｅｒ和Ｅｈｒｌｉｃｈ首次分離出了這種微生物，其分離培養(yǎng)困難。在顯微鏡下觀察，副豬嗜血桿菌短小、無(wú)運(yùn)動(dòng)、多種形態(tài)，從單個(gè)的球桿菌到長(zhǎng)的、細(xì)長(zhǎng)的以至絲狀的菌體。通?？梢娗v膜，但體外培養(yǎng)時(shí)不受影響。該菌生長(zhǎng)只需要Ｖ因子或ＮＡＤ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），不需要Ｘ因子，屬巴斯德菌科。在鮮血瓊脂平板與葡萄球菌共劃線培養(yǎng)時(shí)，呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，即越靠近葡萄球菌其生長(zhǎng)越好，遠(yuǎn)離葡萄球菌的地方不生長(zhǎng)，并且在鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

ＨＰＳ具有莢膜多糖抗原和菌體結(jié)構(gòu)抗原。莢膜多糖抗原成分主要是多糖和磷酸壁，具有型特異性；菌體結(jié)構(gòu)抗原包括外膜蛋白（ＯＭＰ）和脂多糖（ＬＰＳ）。ＨＰＳ已知的毒力因子及潛在的毒力因子主要有莢膜、菌毛、外膜蛋白、ＬＰＳ、轉(zhuǎn)鐵蛋白、神經(jīng)氨酸酶等。應(yīng)用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術(shù)可把副豬嗜血桿菌的ＯＭＰ分為兩個(gè)完全不同的生物型，即生物１型和生物２型。李靜怡等［３］在ＨＰＳ中發(fā)現(xiàn)了２個(gè)與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白Ｐ２和Ｐ５，該蛋白與細(xì)菌黏附有關(guān)，在毒力株和非毒力株中Ｐ２的分子質(zhì)量分別為４８ｋu和５５ｋu，因此可通過(guò)Ｐ２蛋白來(lái)區(qū)分毒力株和非毒力株。ＨＰＳ的ＯＭＰ具有較好的免疫原性，Ｍｉｎｉａｔｓ等研究發(fā)現(xiàn)，用含有ＯＭＰ和ＬＰＳ抗原的菌苗免疫動(dòng)物，有ＯＭＰ抗體的豬才能抵抗強(qiáng)毒菌株的感染。副豬嗜血桿菌的ＬＰＳ具有與其他革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素相似的活性，而ＬＰＳ可誘導(dǎo)ＰＣＶ-２在體外培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，增加ＰＣＶ-２在細(xì)胞核內(nèi)的抗原和核酸信號(hào)［４］。

Ｙｕｅ等［５］以國(guó)內(nèi)分離的優(yōu)勢(shì)血清５型菌株ＳＨ０１６５為親本株完成了全基因組測(cè)序，分析鑒定出了２個(gè)潛在區(qū)分強(qiáng)弱毒力菌株的分子靶標(biāo)——ＯＭＰ２和ｓｏｄＡ基因。利用８株已測(cè)序完成的菌株全基因組序列，總結(jié)出１８?jìng)€(gè)主要的毒力相關(guān)基因或操縱子基因。全基因組分析結(jié)果表明，ＳＨ０１６５菌株的基因組由２２６９１５６個(gè)核苷酸組成一個(gè)環(huán)狀染色體，Ｇ＋Ｃ含量高達(dá)３９．９９％，編碼２２９９個(gè)基因?；蚪M同源性方面，副豬嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌遺傳進(jìn)化上最接近，分類上獨(dú)立于嗜血桿菌屬外形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)特的進(jìn)化分支。

１．１ 血清型分型法

基于免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的１５種血清型已被確定。型特異性抗原為對(duì)熱穩(wěn)定的多糖，據(jù)推測(cè)，其可能是莢膜或脂多糖（ＬＰＳ）。副豬嗜血桿菌流行存在明顯地域差異，在日本、德國(guó)、澳大利亞、美國(guó)、加拿大、西班牙和丹麥分離的血清型中顯示，血清型４、５和１３最為常見。間接血凝（ＩＨＡ）試驗(yàn)也可用來(lái)鑒定副豬嗜血桿菌的血清型，用于彌補(bǔ)免疫擴(kuò)散試驗(yàn)分型的局限性，只有６３％的菌株可以通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定血清型，相對(duì)而言ＩＨＡ可達(dá)９０％以上。目前國(guó)內(nèi)建立了基于微量玻片凝集的血清學(xué)定型方法（ＮＹ／ＳＹ５４１－２００５），其基本原理是用超波破碎細(xì)菌菌體細(xì)胞后再與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行凝集反應(yīng)。

１．２ 基因分型法

為克服副豬嗜血桿菌血清學(xué)分型的局限性，常用基因分型法對(duì)其分型，由于不同菌株具有不同的ＤＮＡ指紋圖譜，基因分型主要用于鑒別菌株間的差異，其優(yōu)點(diǎn)在于敏感性和特異性都較高，可將血清學(xué)方法不能分型的細(xì)菌進(jìn)行歸類。常用的基因分型有限制性內(nèi)切酶指紋圖譜（ＲＥＦ）、多位點(diǎn)酶切電泳（ＭＥＥ）、腸桿菌科基因間重復(fù)序列（ＥＲＩＣ－ＰＣＲ）、限制性酶切片段多態(tài)性分析（ＲＦＬＰ－ＰＣＲ）等。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)副豬嗜血桿菌基因分型研究較多的主要是ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ法，賈愛(ài)卿等［６］應(yīng)用ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法將廣東地區(qū)４８株ＨＰＳ分離株分為３１個(gè)基因亞型，歸類為８?jìng)€(gè)群。另３６．１％不能進(jìn)行血清分型（ＫＲＧ瓊脂擴(kuò)散法）的菌株也得到充分分型，未發(fā)現(xiàn)血清分型與基因分型之間有明顯的相關(guān)性，證實(shí)ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法比傳統(tǒng)血清分型有更高的識(shí)別力，可用于場(chǎng)內(nèi)及場(chǎng)間病原菌的追溯。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型法主要針對(duì)ＨＰＳ的轉(zhuǎn)鐵蛋白Ａ（ｔｂｐＡ）基因和ａｒｏＡ基因進(jìn)行鑒定和分類，通過(guò)ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法分析編碼轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白基因ｔｂｐＡ對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行分型，１５種副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株可產(chǎn)生１２種不同的圖譜，其中血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切圖譜。ＨＰＳ相同的血清型菌株內(nèi)具有遺傳多樣性，且血清型與ＲＦＬＰ群之間沒(méi)有相關(guān)性。李軍星等［７］用基于ｔｂｐＡ基因的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的分型方法對(duì)中國(guó)６省市５７株分離菌株及１５個(gè)參考菌株進(jìn)行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，１５個(gè)血清型參考菌株分為９種基因型，５７個(gè)流行分離株可分為１５種基因型，其中在中國(guó)最為流行的基因型分別為ＤＢＮ（３８％），ＡＢＮ（１８％）與ＤＢＰ（１２％）。目前ＥＲＩＣ－ＰＣＲ和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ基因分型法都是建立在菌株分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上。

２ 流行病學(xué)

豬是副豬嗜血桿菌的天然宿主，通常可從健康豬的鼻分泌物和氣管黏液中分離出細(xì)菌。還可以從患肺炎豬的肺臟中分離出來(lái)，正常豬肺臟是分離不出來(lái)的。全身組織器官中ＨＰＳ分離率明顯高于呼吸系統(tǒng)組織中的ＨＰＳ分離率，臨床分離ＨＰＳ時(shí)應(yīng)多選擇從全身性組織器官中分離。ＨＰＳ可以影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的各個(gè)階段，斷奶前后和保育階段發(fā)病率較高，高達(dá)４０％～５０％?？人?、呼吸困難、消瘦、跛行和背毛粗亂是主要的臨床癥狀。不同血清型菌株毒力存在差異，其中１、５、１０、１２、１３、１４為高毒力菌株；２、４、１５為中等毒力菌株；其他血清型菌株毒力較弱或沒(méi)有毒力。

臨床上可依據(jù)發(fā)病癥狀、剖檢病變和細(xì)菌分離鑒定對(duì)ＨＰＳ作出常規(guī)診斷，進(jìn)一步可根據(jù)１６ＳｒＲＮＡ引物序列建立的ＰＣＲ診斷方法提高檢測(cè)病原的靈敏度，擴(kuò)增的特異性片斷為８２１ｂｐ。該方法檢測(cè)的最小細(xì)菌濃度為１０２ＣＦＵ／ｍＬ，適合于從全身部位采集的病料［８］。

副豬嗜血桿菌可作為豬呼吸道疾病的病原體，也可作為一種預(yù)先影響的因素，引起肺炎的次要或主要病原體。在肺炎中，該菌只在與其他病毒或細(xì)菌協(xié)同時(shí)才引發(fā)疾病。這些病原包括支原體、豬藍(lán)耳病病毒、豬流感病毒、呼吸道冠狀病毒。ＰＲＲＳV感染的豬群中，有５１．２％的肺臟可分離到副豬嗜血桿菌和豬鼻支原體。目前臨床上ＰＣＶ-２與HPS的混合感染也較為普遍。通常早期斷奶的仔豬在母源抗體不存在的情況下，副豬嗜血桿菌的晚期感染可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果。目前在不同群體中混養(yǎng)豬，或引入新種豬，副豬嗜血桿菌的存在是嚴(yán)重問(wèn)題。

３ 免疫與防治

３．１ 疫苗免疫

通過(guò)接種商業(yè)化疫苗和特異性滅活疫苗可以有效地控制該病的發(fā)生。也有使用滅活苗預(yù)防失敗的事例，這可能是因?yàn)椴〕讨谐霈F(xiàn)的菌株血清型不同或疫苗接種時(shí)間控制不當(dāng)缺乏交叉保護(hù)。不同菌株的免疫原性不同并且細(xì)菌的毒力可能與其免疫保護(hù)力呈正相關(guān)［８］。已證實(shí)疫苗免疫可以對(duì)相同血清型不同菌株的感染產(chǎn)生免疫效力。全菌滅活疫苗主要針對(duì)菌株的低脂聚糖產(chǎn)生同種血清型抗體，而菌體蛋白產(chǎn)生的體液抗體能提供高效的免疫保護(hù)，在預(yù)防ＨＰＳ感染和疾病發(fā)生中可發(fā)揮重要作用。不同血清型菌株之間的交叉保護(hù)沒(méi)有一定的相關(guān)性。

國(guó)內(nèi)王金合等［９］、宋鳳香等［１０］報(bào)道用臨床分離株制備自家疫苗對(duì)控制副豬嗜血桿菌有效；Ｍｉｎｉａｔｓ等［１１］比較了ＳＰＦ豬場(chǎng)中商品疫苗和自家疫苗的應(yīng)用，結(jié)果表明臨床分離株的自家疫苗可有效減少該豬場(chǎng)的發(fā)病率。對(duì)母豬和仔豬的免疫可以防止仔豬發(fā)生多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，并且母源抗體并不干擾１周齡和３周齡仔豬的免疫。免疫母豬所產(chǎn)的仔豬很少患肺炎和關(guān)節(jié)炎，仔豬平均日增重高于非免疫母豬所產(chǎn)的仔豬，也不受額外免疫的影響。蔡旭旺等［２］用國(guó)內(nèi)臨床分離株篩選出高毒力４、５型菌株，制備商品疫苗對(duì)母豬及１４日齡仔豬進(jìn)行免疫后，具有較高的保護(hù)率，研究結(jié)果還表明母豬抗體對(duì)仔豬用滅活疫苗免疫后建立主動(dòng)免疫反應(yīng)的過(guò)程沒(méi)有影響，這與國(guó)外研究結(jié)果一致。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的商品苗免疫失敗的還一個(gè)原因可能就是疫苗菌株與臨床典型菌株血清型雖然相同，但兩者基因型卻不同。由于菌株致病力的差異，以及目前對(duì)保護(hù)性抗原的毒性因子缺乏深入的認(rèn)識(shí)，還不可能產(chǎn)生一種對(duì)豬所有的致病菌株同時(shí)產(chǎn)生交叉免疫力的滅活苗。

在基因工程疫苗方面，副豬嗜血桿菌的４個(gè)蛋白（ＰａｌＡ、ＯＭＰ２、Ｄ１５和ＨＰＳ０６２５７）可用于ＨＰＳ疫苗的候選靶蛋白［１２］。對(duì)副豬嗜血桿菌的防控還應(yīng)加強(qiáng)圓環(huán)病毒疫苗（目前主要流行的是ＰＣＶ２ｂ基因亞型）的免疫，特別是免疫斷奶前仔豬（２～４周齡），對(duì)提高哺乳期仔豬的成活率、提高生長(zhǎng)日增重和整齊度、降低ＰＭＷＳ的發(fā)生率和繼發(fā)ＨＰＳ感染更有效。

３．２ 藥物治療

抗生素或口服藥物治療對(duì)嚴(yán)重的副豬嗜血桿菌病暴發(fā)效果不大。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，應(yīng)對(duì)整個(gè)豬群注射大劑量抗生素治療。藥敏及臨床試驗(yàn)證明大多數(shù)菌株對(duì)泰拉菌素、頭孢菌素、氨芐青霉素敏感，對(duì)氟喹諾酮類、增效磺胺類藥物低度敏感。對(duì)副豬嗜血桿菌病的控制方案應(yīng)當(dāng)包括免疫疫苗接種和抗菌素處理，但也應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，如斷奶仔豬飼料中添加支原凈、替米考星、氟苯尼考、多西環(huán)素、電解多維、抗病毒中成藥等藥物；減少或根除其他呼吸道病原（多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體等）；減少豬群流動(dòng)，降低寒冷、潮濕、閹割等因素造成的應(yīng)激反應(yīng)，杜絕生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況。

４ 展望

副豬嗜血桿菌病是近年來(lái)危害養(yǎng)豬業(yè)較大的疾病，其本身的致病機(jī)理較為復(fù)雜，為尋找對(duì)副豬嗜血桿菌病的快速診斷及有效預(yù)防和治療方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其致病機(jī)理等方面做了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)了多種與副豬嗜血桿菌致病性有關(guān)的毒力因子。但其血清型眾多，不同血清型的副豬嗜血桿菌毒力差異很大，各毒力因子間的相互作用、毒力因子與疾病的發(fā)展關(guān)系、以及在新型疫苗研制和協(xié)同感染機(jī)制方面需做進(jìn)一步的研究。特別是目前副豬嗜血桿菌常常涉及到與其他傳染性疾病的混合感染，使豬的呼吸道傳染病更為嚴(yán)重和復(fù)雜，給臨床診斷和防控帶來(lái)了很大的困擾。

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