潘熙萍,樓佳俊,張高精,張麗莎,施曼玲

摘要：通過(guò)碳化二亞胺法將草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）分別與卵清蛋白（ＯＶＡ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯(lián)制備免疫原和包被原。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）檢測(cè)表明，草甘膦與牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶聯(lián)比分別為１１∶１和９∶１。合成的免疫原作用新西蘭大白兔制備出草甘膦多克隆抗體，ＥＬＩＳＡ檢測(cè)抗體溶液效價(jià)為１∶１×１０７，該抗體不與草甘膦的結(jié)構(gòu)類似物增甘膦和雙甘膦起交叉反應(yīng)。以此抗體建立了草甘膦間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法（ｃｉＥＬＩＳＡ），其線性范圍為０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，線性回歸方程為ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８。草甘膦的檢測(cè)限為ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ／ｍＬ。在添加回收試驗(yàn)中，草甘膦添加值５和１０ μｇ／ｇ時(shí)，玉米粉中的草甘膦回收率為１０４．１２％和８１．３７％，小麥粉中的回收率則分別為１１８．９４％和為１０９．３９％。結(jié)果表明，采用所制備的多克隆抗體而建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法可有效地應(yīng)用于玉米粉和小麥粉中草甘膦的殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）；多克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法

中圖分類號(hào)：Ｓ４８２．４文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）05－1002-04

Establishment ｏf ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Assay for Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ

ＰＡＮ Ｘｉ－ｐｉｎｇ，ＬＯＵ Ｊｉａ－ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｇａｏ－ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｓｈａ，ＳＨＩ Ｍａｎ－ｌｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｉｍｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｂｅｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ） ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｈａｐｔｅｎ ｔｏ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｗｅｒｅ １１∶１ ａｎｄ ９∶１ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ． Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ １∶１×１０７ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）． Ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｇｌｙｐｈｏｓｉｎｅ ａｎｄ Ｎ－（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ） ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ． Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｃｉＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ （ＩＣ１０） ｏｆ １．１５ μｇ／ｍＬ ａｎｄ ａ ｌｉｎｅａｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．７８～１００ μｇ ／ｍＬ ｗｉｔｈ ａｎ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｏｆ １４．３５ μｇ/ｍＬ． Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２ ｗａｓ ０．９９３ ８． Ｗｈｅｎ ５ ａｎｄ １０ μｇ／ｇ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｘｅｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ １０４．１２％ ａｎｄ ８１．３７％ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， ｗｈｉｌｅ １１８．９４％ ａｎｄ １０９．３９％ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｂｌａｎｋ ｓａｍｐｌｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｉＥＬＩＳＡ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ

草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）化學(xué)名為Ｎ－（膦酸甲基）甘氨酸，是一種非選擇性廣譜除草劑，是當(dāng)前世界上應(yīng)用最廣、生產(chǎn)量最大的除草劑，也是目前我國(guó)使用量最大的除草劑［１］。先前的研究表明草甘膦對(duì)哺乳動(dòng)物急性毒性低，且在生物體內(nèi)不易積累，故對(duì)人類和其他哺乳動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生明顯危害［２］。但是，近年越來(lái)越多的研究表明草甘膦對(duì)哺乳動(dòng)物發(fā)育、繁殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響［３－６］。

草甘膦進(jìn)入環(huán)境會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生有害影響，并通過(guò)在食物中的殘留對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。目前，《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》明確規(guī)定了草甘膦在稻谷、小麥、小麥粉、全麥粉、玉米、水果、甘蔗和棉子油中的最大殘留限量。２００６年頒布的國(guó)家《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》也增加了對(duì)草甘膦的檢測(cè)要求。

目前有關(guān)食品中草甘膦殘留分析方法主要采用液相色譜和氣相色譜法，另外還有液－質(zhì)聯(lián)用、氣－質(zhì)聯(lián)用和離子色譜法等［７］。但由于草甘膦極性強(qiáng)，易溶于水，難溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，沒(méi)有發(fā)色和熒光基團(tuán)等特性，使得液相色譜法需要各種衍生技術(shù)的使用。此外，草甘膦與自然界存在的氨基酸和氨基糖的相似性，也使采用色譜法測(cè)定谷物與動(dòng)物產(chǎn)品中的草甘膦殘留更加困難，必須借助于繁瑣的離子交換柱凈化程序，但實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，難度大，無(wú)法滿足草甘膦快速檢測(cè)的需要。因此，研制草甘膦殘留的快速檢測(cè)方法，加強(qiáng)食品和環(huán)境中草甘膦殘留的檢測(cè)與監(jiān)控，對(duì)保障人類健康具有重要意義。本研究制備了草甘膦的多克隆抗體，并建立了快速靈敏的草甘膦間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研制免疫檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料和儀器

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品純度＞９９％，購(gòu)自德國(guó)Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、辣根過(guò)氧化物酶（ＨＲＰ）標(biāo)記羊抗兔抗體（酶標(biāo)二抗）、弗氏完全佐劑（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐劑（ＦＩＡ）均購(gòu)自Ｓｉｇｍａ公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。新西蘭雄性大白兔購(gòu)自杭州師范大學(xué)動(dòng)物中心。主要儀器設(shè)備包括ＢＩＯ－ＲＡＤ ６８０型酶標(biāo)儀，Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ型基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，美國(guó)Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ公司）。

１．２草甘膦包被原和免疫原的制備與鑒定

草甘膦包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ的制備方法參照文獻(xiàn)［８］。通過(guò)ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質(zhì)譜儀測(cè)定ＧＬＹ與ＢＳＡ以及ＧＬＹ與ＯＶＡ偶聯(lián)前后分子質(zhì)量的變化，以判斷偶聯(lián)是否成功，并計(jì)算偶聯(lián)比。

１．３草甘膦多克隆抗體的制備及純化

２ ｍL免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ與等體積弗氏完全佐劑乳化后，采用背部皮下和腋窩多點(diǎn)注射的方法免疫新西蘭大白兔。２周后，２ ｍｇ ＧＬＹ－ＯＶＡ與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后注射免疫，免疫方法同上。之后每間隔１周加強(qiáng)免疫１次，兔子耳靜脈采血測(cè)定抗體效價(jià)。最后一次免疫劑量加倍，免疫后７ ｄ頸部采血，血樣在室溫下靜置凝結(jié)３０ ｍｉｎ后，４ ℃下過(guò)夜，次日離心取上清分裝后于－２０ ℃保存。采用飽和硫酸銨鹽析法純化抗血清溶液，純化后抗體溶液分裝置于－８０ ℃保存。

１．４草甘膦多克隆抗體的鑒定及效價(jià)測(cè)定

用間接ＥＬＩＳＡ法進(jìn)行草甘膦多克隆抗體鑒定及抗體效價(jià)測(cè)定，具體步驟如下：①包被。分別以ＯＶＡ、ＢＳＡ、ＧＬＹ－ＢＳＡ為包被原，倍比稀釋后加入酶標(biāo)板中，１００ μＬ／孔，４ ℃過(guò)夜；洗滌３次，每次間隔３ ｍｉｎ，拍干。②封閉。加入５ ％ 脫脂奶粉封閉，２００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，拍干。③加一抗。加入倍比稀釋的草甘膦抗體１００ μＬ，３７ ℃溫育１ ｈ，洗滌同上。④加酶標(biāo)二抗。加入１∶１０ ０００ 稀釋的羊抗兔酶標(biāo)二抗，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，洗滌同上。⑤顯色。加入ＴＭＢ底物顯色液，１００ μＬ／孔，３７ ℃顯色１５ ｍｉｎ。⑥終止讀數(shù)。加入２ ｍｏｌ／Ｌ的硫酸終止顯色反應(yīng)，５０ μＬ／孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定其ＯＤ４５０nm值。設(shè)置陰性對(duì)照，以ＯＤ值Ｐ／Ｎ＞２．１為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

１．５間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）檢測(cè)方法的建立

分別將包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和草甘膦多克隆抗體溶液倍比稀釋，進(jìn)行間接ＥＬＩＳＡ方陣實(shí)驗(yàn)，選取ＯＤ４５０nm值在１．０左右的包被原和抗體濃度為最適工作濃度。建立ｃｉＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)步驟如下：以最適工作濃度的ＢＳＡ－ＧＬＹ為包被原包被酶標(biāo)板，４ ℃過(guò)夜，洗滌，封閉；１００ μＬ草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液與等體積最適工作濃度的草甘膦抗體混合，設(shè)置空白對(duì)照和不抑制對(duì)照，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，然后轉(zhuǎn)移到封閉好的酶標(biāo)板中，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，洗滌。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟如加酶標(biāo)二抗、顯色和終止讀數(shù)同１．４中方法。

１．６標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配制０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５０、２５．００、５０．００和１００．００ μｇ／ｍＬ的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用ｃｉＥＬＩＳＡ法測(cè)定不同濃度的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)抗體與包被原結(jié)合的抑制率，抑制率按文獻(xiàn)［９］中的公式進(jìn)行計(jì)算。以草甘膦各標(biāo)準(zhǔn)品溶液的對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以ＩＣ５０來(lái)衡量抗體對(duì)草甘膦的親和力，以ＩＣ１０為該ＥＬＩＳＡ方法的檢測(cè)靈敏度指標(biāo)。

１．７草甘膦多克隆抗體的特異性測(cè)定

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法，分別測(cè)定草甘膦多克隆抗體與草甘膦結(jié)構(gòu)類似物雙甘膦、增甘膦的交叉反應(yīng)率，根據(jù)交叉反應(yīng)率高低鑒定抗體的特異性。交叉反應(yīng)率的計(jì)算公式如下：

交叉反應(yīng)率＝（ＧＬＹ的ＩＣ５０／ＧＬＹ類似物的ＩＣ５０）×１００％。

１．８添加回收試驗(yàn)

?。?ｇ空白樣品（小麥粉和玉米粉）溶于水，添加草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品，使樣品的濃度為５和１０ μｇ／ｇ。添加回收試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［９］，并計(jì)算添加回收率。

２結(jié)果與分析

２．１草甘膦包被原與免疫原的制備與鑒定結(jié)果

通過(guò)碳化二亞胺法將ＧＬＹ分別與ＢＳＡ和ＯＶＡ偶聯(lián)，偶聯(lián)物通過(guò)ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質(zhì)譜儀測(cè)定分子質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖１和圖２。質(zhì)譜檢測(cè)表明２個(gè)偶聯(lián)物ＧＬＹ－ＢＳＡ和ＧＬＹ－ＯＶＡ的分子質(zhì)量分別為６９ ０４０．１ u和５３ ６２６．９ u，與ＢＳＡ的６７ ２２９．２ u和ＯＶＡ的５２ １７０．２ u的分子質(zhì)量差異明顯，說(shuō)明偶聯(lián)成功。計(jì)算得出１分子ＢＳＡ與１１分子的ＧＬＹ偶聯(lián)，１分子ＯＶＡ與９分子的ＧＬＹ偶聯(lián)，即ＧＬＹ與ＢＳＡ、ＧＬＹ與ＯＶＡ的偶聯(lián)比分別為１１∶１和９∶１。

２．２草甘膦多克隆抗體的純化、鑒定及效價(jià)測(cè)定結(jié)果

采用飽和硫酸銨法對(duì)獲得的草甘膦抗血清進(jìn)行純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后的多抗溶液濃度為３．６８ ｍｇ／ｍＬ。間接ＥＬＩＳＡ檢測(cè)表明所制備的草甘膦多抗與ＧＬＹ－ＢＳＡ呈陽(yáng)性反應(yīng)。該試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了通過(guò)免疫、純化等實(shí)驗(yàn)過(guò)程已成功獲得草甘膦多克隆抗體。間接ＥＬＩＳＡ方法測(cè)得草甘膦多抗溶液效價(jià)為１∶１×１０７。

２．３ｃｉＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法的建立

包被原原始濃度為１．２１ ｍｇ／ｍＬ，將包被原和草甘膦多抗分別倍比稀釋，利用間接ＥＬＩＳＡ進(jìn)行方陣試驗(yàn)，考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)要求有較高的檢測(cè)靈敏度，并盡可能減少非特異性反應(yīng)，確定ｃｉＥＬＩＳＡ分析方法中包被原與草甘膦多抗的最適工作濃度為：包被原稀釋倍數(shù)為２．０×１０４，草甘膦多抗稀釋倍數(shù)為４．０×１０３。

２．４標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法檢測(cè)，并根據(jù)公式計(jì)算不同濃度的草甘膦對(duì)抗體的抑制率。以草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液的對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制草甘膦標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖３），表明草甘膦在０．７８～１００ μｇ／ｍＬ范圍內(nèi)，抑制率與濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ｙ＝１５．８５１ 0 ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ/ｍＬ，ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，即抑制率為１０％時(shí)草甘膦的檢測(cè)限為１．１５ μｇ／ｍＬ。

２．５ 草甘膦多克隆抗體的特異性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)ｃｉＥＬＩＳＡ法檢測(cè)、計(jì)算出草甘膦多抗與草甘膦及類似物的交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表１。草甘膦多抗與雙甘膦和增甘膦的交叉反應(yīng)率均小于０．０１％，而與草甘膦的交叉反應(yīng)率為１００％，說(shuō)明所制備的草甘膦多抗具有較高的特異性。

２．６添加回收試驗(yàn)結(jié)果

選擇ＧB２７６３－２００５所規(guī)定的草甘膦殘留檢測(cè)的兩種農(nóng)產(chǎn)品小麥粉和玉米粉的空白樣品，進(jìn)行草甘膦添加回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表２。草甘膦添加值為５ μｇ／ｇ和１０ μｇ／ｇ時(shí)，玉米粉中的回收率分別為１０４．１２％和８１．３７％；小麥粉中的回收率則分別為１１８．９４％和１０９．３９％。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用所制備的多克隆抗體建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，可有效地應(yīng)用于玉米粉和小麥粉中草甘膦的殘留檢測(cè)。

３小結(jié)與討論

以抗原抗體的特異性反應(yīng)為核心的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展最快的微量檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥、抗生素等殘留的檢測(cè)［１０］。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器設(shè)備和人員素質(zhì)要求低以及樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大規(guī)模樣品篩選［１１］，ＥＬＩＳＡ技術(shù)也為草甘膦殘留分析提供了新方法，Ｃｌｅｇｇ等［８］制備了兔抗草甘膦多克隆抗體，建立了草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)７．６ μｇ／ｍＬ。本研究利用抗血清制備技術(shù)獲得了高特異性的草甘膦多克隆抗體，間接ＥＬＩＳＡ檢測(cè)結(jié)果表明草甘膦多抗效價(jià)為１∶１×１０７。采用所制備的多克隆抗體建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，其檢測(cè)草甘膦的線性范圍為０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，檢測(cè)限ＩＣ１０為１．１５ μｇ/ｍＬ，比Ｃｌｅｇｇ等報(bào)道的低，因而檢測(cè)更靈敏，可有效地應(yīng)用于小麥粉和玉米粉中的草甘膦殘留檢測(cè)。草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法的建立，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)免疫檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)，并為食品和環(huán)境中草甘膦殘留的監(jiān)控提供便捷、快速和靈敏的檢測(cè)方法。

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