鄭 暉 許紹發(fā) 賈鴻彥 古淑香

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院麻醉科，北京 101149;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院胸外科，北京 101149;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)由于發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，同時(shí)缺乏有效的治療手段，發(fā)病率和病死率仍居高不下。研究［1］顯示其發(fā)病基礎(chǔ)與Toll－樣受體(Toll-like receptors，TLRs)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)是新近學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一條神經(jīng)－免疫調(diào)節(jié)通路［2］，它通過迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿與免疫系統(tǒng)相互作用，參與抗炎作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果［3］已經(jīng)證實(shí)，CAP可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子的產(chǎn)生和釋放，但其確切的作用靶點(diǎn)是否與TLRs有關(guān)目前未見報(bào)道。本研究擬采用電刺激迷走神經(jīng)和靜脈注射膽堿酯酶抑制劑他克林的方法激活CAP，觀察其對(duì)內(nèi)毒素復(fù)合油酸2次打擊致大鼠急性肺損傷的影響，并驗(yàn)證其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀 (美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x(瑞士AVL公司)，450 nm酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-200，成都泰盟科技有限公司)，脂多糖(美國SIGMA公司)，油酸(分析純)(北京金龍科技有限公司)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(美國 MARKET公司)，羊抗 NF-κBp65單抗(武漢博士德生物工程公司)，大鼠IgG免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，髓過氧化物酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(北京賽百盛生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

24只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，SCXK:京2005－0004)，體質(zhì)量250±20g。實(shí)驗(yàn)前于本所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2周，常規(guī)飼料及飲水，晝夜交替12 h，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)。制模型前禁食不禁水12 h。2%戊巴比妥40 mg·kg－1腹腔注射麻醉后，沿正中線切開頸部皮膚，切開氣管，置入14G套管，與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接行機(jī)械通氣，潮氣量:3～5 mL，呼吸頻率:40～50次/min，吸入氧濃度:21%。分離右側(cè)股靜脈，置入22G套管針以作注射藥物之用，穩(wěn)定10 min后開始分組操作并監(jiān)測。按數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分4組，每組6只。①對(duì)照組(control group，C組):腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10 mL·kg－1;②急性肺損傷組(ALI組):腹腔注射1%內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)10 mg·kg－1，30 min后經(jīng)股靜脈緩慢注射油酸(oleic acid，OA)0.15 mL·kg－1;③電刺激組(stimulation group，ST組):右頸迷走神經(jīng)干連接刺激電極，以5 V、2 ms、1 Hz 強(qiáng)度持續(xù)刺激神經(jīng) 10 min，腹腔注射1%LPS 10 mg·kg－1，再持續(xù)刺激神經(jīng)10 min，20 min后經(jīng)股靜脈緩慢注射OA 0.15 mL·kg－1;④他克林(tetrahydroaminoacridine，THA)組:靜脈注射THA 1.5 mg·kg－1，10 min 后行 ALI組操作。130 min 時(shí)活殺大鼠后取左肺組織，無菌冰0.9%氯化鈉注射液中洗凈肺內(nèi)血液，立即分裝保存于液氮中。從頸總動(dòng)脈采血2 mL置于無菌無致熱原Eppendorf管中，離心(4 000 r/min，4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。

1.2.2 血中pH和氣壓的檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)抽取動(dòng)脈血檢測pH值、血氧分壓(partial pressure of oxygen，PaO2)和二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)。

1.2.3 病理學(xué)檢查

處死大鼠，剖胸肉眼觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變，取右肺下葉組織，經(jīng)固定、包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察，根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎細(xì)胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成、肺不張改變，按程度“無、輕、中、重”分別計(jì)“0、1、2、3 分”，然后累計(jì)總分［4］。

1.2.4 肺組織含水量測定

取右肺上葉組織用冷0.9%氯化鈉注射液沖去殘血，濾紙吸干水分在分析天平上精確稱量濕質(zhì)量(wet weight，W)，于80℃烘干 72h，再稱量干質(zhì)量(dry weight，D)，以濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值(W/D)表示肺組織含水量。

1.2.5 肺組織髓過氧化物酶(mycloperoxidase，MPO)測定

取部分左肺組織制備10%組織勻漿，不離心，用蛋白定量(雙縮脲法)測試盒測定組織勻漿蛋白濃度，用比色法測定肺組織MPO含量，以每克組織濕片中MPO活力單位表示。

1.2.6 左肺核轉(zhuǎn)錄因子－κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65含量檢測

采用免疫印跡方法檢測左肺組織中NF-κBp65含量。具體步驟:肺組織30 mg，加入裂解液中勻漿，離心(12 000 r/min，4℃)30 min，取上清，Bradford 法測定總蛋白濃度。樣本各取40 μg上樣，行10%SDSPAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，羊抗NF-κBp65單抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG 37℃孵育1 h，ECL顯像成影。掃描后用HPIAS-1000凝膠分析系統(tǒng)定量，計(jì)算光密度值(A)。

1.2.7 血清白細(xì)胞介素－6(interleukin-6，IL-6)含量測定

處死大鼠時(shí)從頸總動(dòng)脈采血2 mL置于無菌無致熱源Eppendorf管中，離心(4 000 r/min 4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。采用固相三明治夾心、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血漿IL-6含量。

1.2.8 左肺組織TLR2和TLR4mRNA表達(dá)

采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)方法。具體步驟:取肺組織約100 mg抽提與純化總RNA。實(shí)驗(yàn)所用引物應(yīng)用呂鏜烽等［5］設(shè)計(jì)的引物，委托賽百盛公司合成。tlr2引物序列:上游引物:5'-AGT GAG TGG TGC AAG TAT GA-3';下游引物:5'-TAA GGC AAG ACA GAA ACA GG-3'。tlr4引物序列:上游引物:5'-CTG CAA TCA AGA GTG CTG AG-3';下游引物:5'-TTC TTG GCT TGA CCA GTC TC-3'。β-actin引物序列:上游引物:5'-ACT GCC GCA TCC TCT TCC TC-3';下游引物:5'-AAG CAT TTG CGG TGC ACG A-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后應(yīng)用凝膠成像儀拍照，凝膠分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，根據(jù)Marker確認(rèn)目標(biāo)基因擴(kuò)增片段的條帶，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值(tlr/β-actin ratio)表示 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，均數(shù)多重比較采用Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血?dú)庵笜?biāo)及病理學(xué)改變

ALI組與C組比較，pH，PaO2和PaCO2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);ST組和THA組與ALI組比較，pH，PaO2和PaCO2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，詳見表1。肉眼觀察，C組左肺呈鮮紅色;ALI組呈暗紫色，彈性差，支氣管內(nèi)可見粉紅色液體;ST組和THA組顏色稍暗。光鏡下ALI組肺泡破壞嚴(yán)重，大量組織液滲出;ST組和THA組大鼠肺組織充血，肺泡擴(kuò)張(圖1)。病理學(xué)評(píng)分詳見表1。

2.2 肺W/D及MPO改變

ALI組與C組比較肺組織W/D及MPO活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);ST組和THA組與ALI組比較2種測量值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 4組動(dòng)物動(dòng)脈血?dú)饧安±韺W(xué)評(píng)分結(jié)果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

表1 4組動(dòng)物動(dòng)脈血?dú)饧安±韺W(xué)評(píng)分結(jié)果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

△1 mmHg=0.133 kPa;*P＜0.05 vs C group;＊＊P＜0.01 vs C group;▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;PaO2:partial pressure of oxygen;PaCO2:partial pressure of carbon dioxide.

圖1 4組大鼠肺組織病理改變Fig.1 Pathological changes of lung tissue of the 4 groups of rats(HE，100×)

表2 肺組織W/D值和MPO活性比較Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

表2 肺組織W/D值和MPO活性比較Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

＊＊P＜0.01 vs C group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;W/D:wet weight/dry weight;MPO:mycloperoxidase.

Group W/D MPO activity/(U·g－1)C group 4.52±0.64 0.36±0.08 ALI group 8.44±0.67＊＊ 1.20±0.14＊＊ST group 5.68±0.82▲ 0.42±0.06▲▲__THA group 5.02±0.66▲ 0.55±0.08▲▲______

2.3 肺組織 TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)、NF-κB p65及血清IL-6濃度改變

4組大鼠肺組織tlr2、tlr4和β-actin基因表達(dá)產(chǎn)物通過RT-PCR方法所得的特異性DNA片段長度分別為256 bp、355 bp和440 bp，與預(yù)期長度相符(圖2A)。與C組比較，其余3個(gè)實(shí)驗(yàn)組肺組織TLR2和TLR4mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其他組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)(圖2B，2C)。ALI組與C組比較肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，IL-6濃度顯著升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);ST組、THA組與ALI組比較，NF-κB p65表達(dá)均減弱;血清IL-6濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見圖3，圖4。

3 討論

圖2 4組大鼠肺組織TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.2 Results of TLR2，TLR4 mRNA RT-PCR of the 4 groups of rats(n=6，)

圖3 4組大鼠肺組織NF-κB p65蛋白水平Fig.3 Comparison of expression of NF-κB p65 protein in lung tissues of the 4 groups(n=6，)

圖4 4組大鼠血清IL-6濃度Fig.4 Serum level of IL-6 in rats of the 4 groups(n=6，)

大多數(shù)肺損傷病人是在受到一次打擊 (如燒傷、失血等)后，當(dāng)全身性炎性反應(yīng)已經(jīng)消退的時(shí)候如果出現(xiàn)感染或缺血再灌注損傷等“2次打擊”，機(jī)體發(fā)生的抗炎性反應(yīng)抑制了免疫反應(yīng)，病人對(duì)感染失去抵抗，其后果遠(yuǎn)較單次打擊更為嚴(yán)重。最近關(guān)于ALI的基礎(chǔ)研究成功地建立了不同“2次打擊”動(dòng)物模型［6］。美國國家心肺血液研究小組［7］認(rèn)為這一研究方法有助于從更加貼近臨床的角度揭示急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果證明，內(nèi)毒素復(fù)合油酸激活大鼠肺臟TLR2和TLR4，通過一系列細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量致炎細(xì)胞因子，形成全身性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部病理性改變，從而造成比單一打擊本身更大的損傷。

機(jī)體通過免疫系統(tǒng)對(duì)炎性反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。本世紀(jì)初，Borovibova L A等［8］發(fā)現(xiàn)副交感神經(jīng)主要遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)能有效地抑制LPS刺激外周巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor－α，TNF-α)，刺激迷走神經(jīng)傳出支可抑制大鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)的全身炎性反應(yīng)，因此認(rèn)為迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)有抗炎作用［9］。有研究［10］顯示Ach可抑制巨噬細(xì)胞中TNF蛋白表達(dá)，但對(duì)TNF mRNA的轉(zhuǎn)錄無影響，表明CAP是在轉(zhuǎn)錄后水平影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程從而抑制細(xì)胞因子合成的。另有研究［11］證實(shí)，煙堿可以抑制內(nèi)毒素引起的NF-κB途徑的活化，但是對(duì)于CAP在細(xì)胞內(nèi)通過何種途徑發(fā)揮作用至今沒有明確。

本研究RT-PCR結(jié)果證實(shí)了電刺激迷走神經(jīng)和靜脈注射THA沒有引起ALI大鼠肺組織TLR2和TLR4mRNA顯著改變，但是可以顯著降低肺組織NF-κBp65和血清IL-6蛋白含量。電刺激迷走神經(jīng)致使外周神經(jīng)末梢大量釋放Ach;THA是一種特異性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，它可以抑制膽堿酯酶的降解作用，阻止已釋放的Ach的清除，引起Ach較高濃度的聚集，發(fā)揮更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。有實(shí)驗(yàn)［12］證明，靜脈注射THA可以減少失血性休克大鼠血漿TNFα和肝組織NF-κB的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)證明通過以上兩種方法增加的Ach對(duì)致炎物質(zhì)激活TLRs的作用沒有直接影響，但是可以阻斷其下游的NF-κB活化，使NF-κB不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而減少了炎癥因子的合成和釋放。有研究者［13］檢測了煙堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB和NF-κB抑制蛋白家族成員活性的影響，結(jié)果顯示，煙堿減少人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在TNFα作用后NF-κB的核轉(zhuǎn)移。因此本研究組認(rèn)為，CAP是在轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮作用的。

本實(shí)驗(yàn)中電刺激迷走神經(jīng)與靜脈注射THA的作用相似，都增加了具有抗炎作用的遞質(zhì)Ach的濃度，發(fā)揮了CAP更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。CAP通過抑制ALI大鼠肺組織NF-κB的活化，減少了IL-6等促炎因子的釋放，使肺組織MPO活性降低，說明中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的扣押減少;ST組和THA組肺組織病理改變較ALI組明顯減輕，W/D值的降低反映了肺組織炎癥滲出減少;血?dú)夥治鼋Y(jié)果的改善說明缺血缺氧得到緩解。以上實(shí)驗(yàn)觀察均說明電刺激迷走神經(jīng)或靜脈注射THA通過興奮CAP可以有效抑制LPS復(fù)合油酸造成的肺損傷。

綜上所述，本研究得出如下結(jié)論:電刺激迷走神經(jīng)或者靜脈注射他克林可通過激活CAP，減輕LPS復(fù)合油酸2次打擊致大鼠ALI時(shí)的炎性反應(yīng);其可能機(jī)制是抑制NF-κB途徑活化，在轉(zhuǎn)錄前水平發(fā)揮抗炎作用，但是不影響ALI時(shí)TLR2和TLR4mRNA的活化。

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