劉鳳松

(中國醫(yī)藥工業(yè)有限公司 質(zhì)量管理部,北京 100190)

唇齒清胃丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂是國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)行動(dòng)計(jì)劃之一。唇齒清胃丸劑型為丸劑，功能為清胃火，用于由胃火引起的牙齦腫痛，口干唇裂，咽喉痛。唇齒清胃丸是由大黃、黃芩、龍膽、梔子等14味中藥材組成的復(fù)方制劑，其中大黃為該藥的君藥[1-2]。本試驗(yàn)采用高效液相法測(cè)定唇齒清胃丸中大黃酚的含量，結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為控制本品質(zhì)量的較好方法。

1 方法

1.1 儀器與試藥 島津LC-2010CHT高效液相色譜儀；島津UV-2450紫外分光光度計(jì)；Mettler AE-163電子分析天平(準(zhǔn)確度:0.000 1 g)；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋；大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：110796-2003)由中國藥品生物制品檢定所提供，甲醇(國藥集團(tuán)試劑公司)為優(yōu)級(jí)純，甲醇(默克)色譜純，水為超純水，三氯甲烷(天津四友化學(xué)品有限責(zé)任公司)、磷酸、鹽酸(天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司)為分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent-C18(5 μ，Φ4.6×250 mm)；以甲醇-0.1%磷酸(85∶15)為流動(dòng)相。流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按大黃酚峰計(jì)算不低于5 000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含大黃酚12.12 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 將本品剪碎，取1 g，精密稱定，加硅藻土1 g，研勻，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放置至室溫，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液20 mL，超聲處理(250 W，40 KHz)2 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h,放置至室溫，置分液漏斗中。用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，靜置分層，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，依次為20、10、10 mL。合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2 方法學(xué)考察

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取大黃酚對(duì)照品甲醇溶液適量，適當(dāng)稀釋，在波長(zhǎng)220～280 nm范圍內(nèi)測(cè)定其紫外吸收光譜(附圖)，測(cè)得大黃酚的最大吸收波長(zhǎng)為255.4 nm,參考《中國藥典》2010年版一部大黃【含量測(cè)定】項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，紫外吸收?qǐng)D譜表明大黃酚對(duì)照品在254 nm有最大吸收，故確定254 nm為大黃酚的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 色譜柱的考察 在實(shí)驗(yàn)過程中曾考察3種色譜柱：1)Diamorsil-C18(5 μ,250 mm×4.6 mm)(迪馬公司)，2)Shim-pack ODS(5 μ，150 mm×6.0 mm)(日本島津公司)，3)Agilent-C(5 μ，Φ4.6×250 mm)，經(jīng)比較后,三根色譜柱的分離效果和色譜峰行為均良好。表明大黃酚對(duì)色譜柱適用性強(qiáng)，比較容易滿足，本試驗(yàn)采用Agilent-C18(5 μ，Φ4.6×250 mm)色譜柱主要是由于其保留時(shí)間較短，理論板數(shù)較高。

2.1.3 提取方法的考察

2.1.3.1 硅藻土加入量的考察 在供試品溶液制備的摸索過程中，試驗(yàn)比較了加入硅藻土0.5、1、1.5 g后測(cè)定其大黃酚的量,結(jié)果加入0.5 g硅藻土的樣品由于樣品分散不完全，測(cè)定結(jié)果偏低；加入1、1.5 g的結(jié)果基本一致。所以本試驗(yàn)采用加入硅藻土的量為1 g。

2.1.3.2 甲醇加入量的考察 在供試品溶液制備的摸索過程中，試驗(yàn)比較了分別加入甲醇25、50、100 mL后測(cè)定其大黃酚的含量，結(jié)果加入甲醇25 mL的樣品由于甲醇量較少,對(duì)大黃酚的提取不充分，測(cè)定結(jié)果偏低；加入50、100 mL的結(jié)果基本一致。所以本試驗(yàn)采用加入甲醇的量為50 mL。

2.1.3.3 甲醇液回流時(shí)間的考察 在供試品溶液制備的摸索過程中，試驗(yàn)比較了甲醇回流時(shí)間分別為30、60、90 min后測(cè)定其大黃酚的含量，結(jié)果表明，回流30 min的測(cè)定結(jié)果偏低，可能是由于回流不充分而造成大黃酚提取不完全；回流60 min與回流90 min后的測(cè)定結(jié)果表明，二者測(cè)得的大黃酚含量差異不大,基本一致。本試驗(yàn)采用的甲醇回流時(shí)間為1 h。

2.1.3.4 加入酸溶液的種類及濃度的考察 在供試品溶液制備的摸索過程中，比較了用硫酸，鹽酸兩種酸液分別水解待測(cè)物，結(jié)果表明：硫酸的氧化性過強(qiáng)，在回收溶劑時(shí)易使供試品氧化變黑，對(duì)供試品有一定的破壞作用，測(cè)定結(jié)果偏低；鹽酸的水解效果好，且氧化性較弱，測(cè)定所得大黃酚的量較高，且平行。所以本試驗(yàn)采用加入鹽酸來水解待測(cè)物。

實(shí)驗(yàn)還比較了3種濃度的鹽酸酸水解方法，濃度分別為5%，8%，15%，測(cè)定其大黃酚的量，結(jié)果表明：加入5%的鹽酸后水解不充分，測(cè)的大黃酚含量偏低，且干擾成分過大；加入8%，15%的鹽酸后測(cè)定大黃酚的含量基本一致。所以本試驗(yàn)選取加入鹽酸的濃度為8%。

2.1.3.5 酸水解回流時(shí)間的考察 實(shí)驗(yàn)比較了3個(gè)酸水解回流時(shí)間，分別為1、1.5、2 h，測(cè)定其大黃酚的含量，結(jié)果表明:用3個(gè)回流時(shí)間測(cè)得的大黃酚含量基本一致。本試驗(yàn)采用的三氯甲烷回流時(shí)間為1 h。

2.1.3.6 三氯甲烷提取次數(shù)的考察 實(shí)驗(yàn)比較分析了三氯甲烷提取次數(shù)分別為3、4、5次后測(cè)定其大黃酚的含量，結(jié)果表明：提取4次和提取5次的測(cè)定結(jié)果與提取3次的測(cè)定結(jié)果基本一致,說明提取3次已經(jīng)可以將酸液中剩余的大黃酚基本提取完全。本試驗(yàn)采用的三氯甲烷提取次數(shù)為3次。

2.2 陰性對(duì)照試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，取按處方配比不含大黃的陰性對(duì)照樣品，依法測(cè)定，結(jié)果陰性樣品色譜圖在大黃酚峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近均無干擾峰檢出，從而證明本法是合理可行的。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含12.12 μg的溶液。分別精密吸取1、3、5、7、9、11 μL,注入液相色譜儀，測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，Y=7 200 887.55X-561 9.04(r=1.000 0)。結(jié)果表明,進(jìn)樣量在12.12～133.32 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈良好線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)6次，測(cè)定色譜峰面積值，RSD=0.06%。結(jié)果表明，所用儀器具有良好精密性。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按上述色譜條件在0～24 h內(nèi)測(cè)定其大黃酚峰面積值，結(jié)果RSD=0.12%，表明，在24 h內(nèi)，供試品溶液中大黃酚的含量基本穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一供試品，依上述方法獨(dú)立測(cè)定6次，結(jié)果平均值0.381，RSD=0.76%。結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性良好，精密度較高。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同法測(cè)定已知含量的供試品6分，每分約0.5 g,分別精密加入大黃酚對(duì)照品甲醇溶液(濃度為0.062 8 mg/mL)3 mL，揮干，加硅藻土1 g，研勻，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱重，加熱回流1 h，放置至室溫，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，置燒瓶中,揮去溶劑，加8%鹽酸溶液20 mL，超聲2 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放至室溫，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，靜置分層，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，依次為20、10、10 mL。合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液依法測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)得平均回收率為99.74%；RSD=0.59%。結(jié)果表明,本法回收率較高，準(zhǔn)確度良好。

2.8 最低定量限的測(cè)定 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含大黃酚12.12 μg的溶液，精密量取1 mL,置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密量取0.5 μL注入液相色譜儀，此時(shí)所得對(duì)照品峰高為噪聲的10倍，按照《中國藥典》規(guī)定，此時(shí)對(duì)照品的進(jìn)樣量為定量限，故此方法的定量限為0.121 2 μg。

3 樣品測(cè)定結(jié)果

依上述方法測(cè)定樣品6批，結(jié)果見表1。

表1 6批含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 流動(dòng)相的選擇 在實(shí)驗(yàn)中曾考察3種流動(dòng)相結(jié)果：磷酸的酸度適中，不易揮發(fā)，且腐蝕性較小，測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性良好，因此選用甲醇-0.1%磷酸(85∶15)為此次試驗(yàn)的流動(dòng)相。

4.2 流動(dòng)相比例的選擇 本次試驗(yàn)[4]采用過2種不同的流動(dòng)相比例：結(jié)果甲醇-0.1%磷酸比例為85∶15時(shí)，理論板數(shù)較高，色譜峰行為好，且保留時(shí)間較短，因此選用甲醇-0.1%磷酸(85∶15)為本法流動(dòng)相。

4.3 柱溫的選擇 選擇使用30 ℃柱溫，可減小流動(dòng)相黏度降低柱壓，提高柱效，改善分離的選擇性，而不影響柱壽命。同時(shí)既可獲得穩(wěn)定的保留時(shí)間，又可縮短實(shí)驗(yàn)周期。

4.4 方法的選擇 參考文獻(xiàn)資料[3-4]證明，本文采用的樣品處理方法，其分離度好，無干擾，峰信號(hào)較強(qiáng)。能夠有效的控制唇齒清胃丸的質(zhì)量。

[1]吳立軍.天然藥物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:151.

[2]俞森.大黃HPLC指紋圖譜及其化學(xué)成分的研究[D].成都:四川大學(xué),2005.

[3]徐雄良,張志榮,黃園.注射用大黃粉針劑的高效液相色譜分析[J].色譜,2003,21(6):596-598.

[4]常明向,章晶,陳科力.黃連、赤芍及大黃對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素釋放的影響[J].中成藥,2007,29(5):752-753.