張 璐辛 陽趙 陽李 軍

（1 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 沈陽市公安局皇姑分局 遼寧 沈陽 110036）

16BT試劑盒在DNA檢驗鑒定中的應(yīng)用

張 璐1辛 陽1趙 陽2李 軍1

（1 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 沈陽市公安局皇姑分局 遼寧 沈陽 110036）

采用16BT試劑盒多個熒光標(biāo)記STR位點及ABO基因位點復(fù)合擴增檢測技術(shù)進行檢驗鑒定，取得滿意效果。說明該試劑盒靈敏度較高，可靠性好，符合目前實際辦案的需要。

熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴增 ABO基因

ABO血型系統(tǒng)是人類發(fā)現(xiàn)最早的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，1900年Landerstainer發(fā)現(xiàn)ABO血型系統(tǒng)后，立即被迅速地應(yīng)用于輸血醫(yī)學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)研究和實踐中。隨著對ABO血型系統(tǒng)研究的深入，新的研究成果很快被推廣至人類學(xué)、親緣關(guān)系分析及法醫(yī)學(xué)個體識別等多種領(lǐng)域，并占有舉足輕重的地位，很長時間以來血型系統(tǒng)一直是法醫(yī)物證鑒定中所應(yīng)用的最主要的遺傳標(biāo)記。

傳統(tǒng)的法醫(yī)物證ABO血型檢測的目標(biāo)是紅細(xì)胞膜表面ABH抗原物質(zhì)，即糖脂或糖蛋白，檢驗方法主要是采用諸如吸收實驗、解離實驗、混合凝集實驗、酶聯(lián)免疫實驗等血清學(xué)方法。血清學(xué)方法只能判定ABO血型的表現(xiàn)型，而且血清學(xué)的結(jié)果判定可能因為外界條件對抗原活性的破壞、細(xì)菌污染、個體分泌狀態(tài)、個體發(fā)育狀態(tài)甚至可能受到機體所患疾病的影響，而導(dǎo)致判型失敗或判型錯誤的結(jié)果發(fā)生。

1990年后，Yamamoto等通過對ABO基因的分析發(fā)現(xiàn)了各等位基因的核苷酸序列差異，為人們從分子水平進行ABO基因分型打下基礎(chǔ)。尤其是隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，世界各地的學(xué)者開展了大量的ABO血型基因分型的研究工作，并報道了一系列的檢驗方法。這些方法包括PCR-RFLP、PCR直接測序和序列特異性引物擴增（PCR-SSP）等方法，其中由于PCR-SSP方法操作相對簡單、檢測速度較快并且判型準(zhǔn)確，是研究最多和應(yīng)用最廣泛的一種。16BT試劑盒即是采用PCR－SSP的原理對多個熒光標(biāo)記STR位點及ABO基因位點復(fù)合擴增進行檢驗鑒定。

1 材料與方法

142份精斑檢材均取自本檢驗室受理的全國各地強奸及強奸殺人案例樣本。

1.1 DNA提取

所有檢材均按GA/T 383-2002 Chelex法提取DNA。

1.2 PCR擴增

聯(lián)合應(yīng)用AB公司的Identifiler試劑盒和基點公司的16BT試劑盒進行PCR擴增，檢測17個STR基因座：D3S1358、vWA、FGA、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、CSF1PO、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、PentaE、PentaD。PCR反應(yīng)在PE-9700擴增儀上進行，PCR擴增體系和循環(huán)條件按操作手冊完成。

1.3 擴增產(chǎn)物檢測

擴增產(chǎn)物經(jīng)AB-3130型DNA遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用Run 3130 Data Collection v3.0軟件收集電泳信息，Genemapper ID v3.2軟件分析擴增片段大小，得到STR分型結(jié)果(如圖1，圖2)。

2 結(jié)果

142份精斑檢材中，AO基因型38例，占26.76%；AA基因型6例，占4.23%；BO基因型30例，占21.13%；BB基因型8例，占5.63%；AB基因型26例，占18.31%；OO基因型34例，占23.94%。

所有檢材兩個試劑盒共同的13個基礎(chǔ)位點檢測結(jié)果完全相同。

圖1 20號檢材Identifiler試劑盒檢測結(jié)果

圖2 20號檢材16BT試劑盒檢測結(jié)果

3 討論

基因擴增方法檢測血型與傳統(tǒng)方法檢測血型比較,檢測的目標(biāo)是DNA，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。傳統(tǒng)血清學(xué)檢驗的細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)抗原，其決定因素也是DNA，因此對DNA檢測更準(zhǔn)確，而且基因分型更多。另外，DNA與蛋白質(zhì)相比，對于各種外界條件的影響和破壞具有更好的耐受性，因此針對微量、陳舊的生物檢材檢驗的成功率和靈敏度也更高。采用血清學(xué)方法對于弱分泌型個體除血液外其他體液成分進行ABO血型檢驗時，常常由于其中抗原成分過少而無法檢驗，甚至得到錯誤判型。而采用ABO血型基因分型方法時，直接檢驗其血型決定基因，因此不受個體分泌狀態(tài)的影響，可以直接獲得準(zhǔn)確結(jié)論。

性犯罪中的精液與陰道液混合斑是法醫(yī)物證鑒定中常見的生物檢材，采用血清學(xué)方法只能獲得混合的ABO血型，再采用加減法進行排除分析；采用基因分型的方法由于首先去除了混合斑中的女性成分，可以直接確定精子的血型。基因擴增方法檢測血型適合于檢測微量樣本。血清學(xué)檢測抗原抗體反應(yīng)，信號放大倍數(shù)通常是幾倍或十幾倍，靈敏度較低，而PCR方法先將基因擴增至少105－106倍后檢測，靈敏度大大提高。

本組實驗中所有檢材兩個試劑盒共同的13個基礎(chǔ)位點檢測結(jié)果完全相同，說明16BT試劑盒靈敏度較高，可靠性好，符合目前實際辦案的需要。

4 典型案例

2012年4月30日，我DNA檢驗室受理某市公安局刑警大隊送檢案件。據(jù)送檢人介紹：2012年4月28日19時40分許，該市某鎮(zhèn)居民發(fā)現(xiàn)自己7歲大的孫女失蹤，并于當(dāng)晚22時06分報案。民警與其親屬50余人在附近尋找一夜未果。4月29日11時10分，在其家屬區(qū)東側(cè)60米處的防水溝內(nèi)發(fā)現(xiàn)了失蹤女童的尸體。經(jīng)技術(shù)人員現(xiàn)場勘查，初步確定為強奸殺人案。

DNA檢驗室受理此案后，首先確定了檢驗方案。為了給辦案機關(guān)節(jié)約辦案成本，我們利用16BT試劑盒成功檢驗出送檢生物物證中犯罪嫌疑人的常染色體STR多態(tài)性分型結(jié)果的同時，還檢驗出犯罪嫌疑人為BO的雜合體。所以我們建議辦案機關(guān)首先送檢B型血的犯罪嫌疑人血樣。這無疑既幫助送檢機關(guān)減少了工作量，又為快速破案爭取了時間。終于，在第三批送檢的B型嫌疑人血樣里，我們找到了真正的兇犯，犯罪嫌疑人被成功批捕。

1.侯一平，王保捷.法醫(yī)物證學(xué)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004

2.裴黎.現(xiàn)代DNA分析技術(shù)理論與方法[M].北京：人民公安大學(xué)出版社，2002

3.鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析［M］.北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2010

4.胡蘭.法醫(yī)遺傳學(xué)進展與應(yīng)用[M].北京：群眾出版社，2008

5.Wang Hong-xu，Wei Zheng，Yong Bingxiang，etal.ABO bloodtypeisassociatedwithendometrial cancer risk in Chinese women[J].Chinese journal of cancer，2011，(11)