李 萍，馮世軍，朱文勝，艾東方，楊秀芳

(1滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001;2青縣人民醫(yī)院)

尖銳濕疣(CA)是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致的一種性傳播疾病，少部分可以癌變。由于其發(fā)病部位及頑固性常給患者帶來巨大的心理壓力和治療費(fèi)用增加，因此進(jìn)一步研究其致病機(jī)理尤為重要。CA是角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖為主要組織病理學(xué)表現(xiàn)的良性病變，已證實(shí)多個(gè)信號通路與之相關(guān)，MAPK途徑及 STAT途徑研究較多，但 Hedgehog (Hh)信號通路與 CA的關(guān)系國內(nèi)外鮮有報(bào)道。2009年5月～2010年12月我們通過檢測Patched-1 (Ptch-1)和Gli-1在CA皮損中的表達(dá)，探討Hh信號通路與CA的關(guān)系，為CA的發(fā)病機(jī)理提供某些理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 CA患者組織標(biāo)本均來自滄州市中心醫(yī)院皮膚科門診，每例均經(jīng)過臨床及組織病理確診，且所有患者取材前未做過治療，共58例，其中男32例、女26例，年齡18～62歲、平均28.2歲，病程3 d～9個(gè)月。正常對照組來源于我院整形美容科手術(shù)切下的正常人健康皮膚，均無任何系統(tǒng)性疾病及皮膚疾病，共15例，其中男6例、女9例，年齡

17～51歲、平均30.8歲。

1.2 主要試劑 Ptch-1和Gli-1抗體均為美國SantaCruz公司產(chǎn)品，兩種抗體工作濃度皆為1∶200。免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 切取的皮損及正常組織均常規(guī)給予10%甲醛固定石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化酶活性，高壓鍋抗原修復(fù)，滴加正常兔血清封閉液，室溫孵育10 min，加入一抗(Ptch-1和Gli-1抗體)工作液，37℃孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記二抗、37℃孵育10～30 min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育10～30 min，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，中性樹脂封片。封片后顯微鏡下觀察，圖像分析、拍照。陰性對照標(biāo)本用PBS代替一抗，用預(yù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)為對本實(shí)驗(yàn)所用抗體呈陽性反應(yīng)的基底細(xì)胞癌連續(xù)切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果示顯微鏡下Ptch-1和Gli-1陽性染色呈黃色或棕黃色顆粒，位于胞質(zhì)或胞膜中。隨機(jī)選取4個(gè)非連續(xù)的高倍鏡視野計(jì)數(shù)，采用陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩項(xiàng)綜合來計(jì)算評分［1］:①陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為3分;②染色強(qiáng)度依據(jù)深淺記分:陰性為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。上述兩項(xiàng)相加即為著色程度積分:結(jié)果是得0～2分為陰性，得3～6分為免疫組化染色陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

15例正常對照組皮膚中Ptch-1陰性為13例，陽性為2例;58例CA患者皮損中Ptch-1陰性21例，陽性為37例(χ2=12.20，P＜0.05)，見封三圖7、8。15例正常對照組皮膚中Gli-1陰性為14例，陽性為1例;58例CA患者皮損中Gli-1陰性19例，陽性者為39例(χ2=17.65，P＜0.05)，見封三圖9、 10。

3 討論

Hh信號通路是1980年由 Nusslein-Volhard和Wieschaus通過基因突變篩選首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，并于1992年克隆成功。它是一個(gè)高度保守的調(diào)控胚胎發(fā)育的信號通路，調(diào)控著神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、生殖系統(tǒng)、皮膚及其附屬器等多個(gè)器官和組織的發(fā)育。Hh信號通路主要由分泌型信號糖蛋白跨膜蛋白受體Ptch和Smo組成的復(fù)合物以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成。Hh與膜受體Ptch結(jié)合后，解除Ptch對Smo的抑制，Smo進(jìn)入胞質(zhì)，將信號下傳，激活鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli，后者進(jìn)入細(xì)胞核，直接激活并啟動(dòng)下游目的基因的表達(dá)［2］。多項(xiàng)研究表明，Hh信號通路異常激活可以引起多種腫瘤(如神經(jīng)管細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等)的形成及發(fā)展［3～7］。

本實(shí)驗(yàn)之所以選用Ptch-1和Gli-1作為研究對象，是因?yàn)樵诩韧亩喾N實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)二者是Hh信號通路中關(guān)鍵作用的結(jié)合點(diǎn)之一。Kinzler等［8］人首次在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)Gli表達(dá)異常升高。Ma等［9］研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌中存在Ptch-1和Gli-1的過度表達(dá)，利用特異性抗體阻斷Hh信號通路后可以抑制胃癌細(xì)胞的生長。Oro等［10］通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型過度表達(dá)Gli或Shh可誘導(dǎo)類似于基底細(xì)胞癌的形成。劉瑛等［11］采用免疫組化和原位雜交方法發(fā)現(xiàn)在鱗狀細(xì)胞癌(scc)皮損中Hh信號通路中的Ptch-1和Gli-1蛋白水平及mRNA的表達(dá)均明顯增加。

近年研究發(fā)現(xiàn)不但在角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化增殖形成的惡性上皮細(xì)胞腫瘤如基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌中存在Hh信號通路過度表達(dá)，而且在以角質(zhì)形成細(xì)胞增殖為主要病理特征的炎癥性皮膚病(如銀屑病)中亦存在表達(dá)增加［12］。CA組織病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖為主的棘層肥厚和乳頭瘤樣增生。本次試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)Ptch-1和Gli-1信號分子在CA過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞中的呈高表達(dá)，進(jìn)一步證明了Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CA皮損中是處于激活狀態(tài)的，且是否表達(dá)與患者性別無明顯相關(guān)性。總之，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步揭示CA發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后CA的治療提供了新的思路。

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