劉紅珍 （山東省鄄城縣畜牧局 274600） 李艷 （山東省胸科醫(yī)院 濟(jì)南） 李穎 （山東省濟(jì)南動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）

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重組DNA技術(shù)及其在動(dòng)物科學(xué)中的應(yīng)用

劉紅珍 （山東省鄄城縣畜牧局 274600） 李艷 （山東省胸科醫(yī)院 濟(jì)南） 李穎*（山東省濟(jì)南動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）

DNA重組技術(shù)是基因工程的核心，指在體外條件下，將不同生物的基因進(jìn)行入工“剪切”“組合”和“拼接”，使遺傳物質(zhì)重新構(gòu)建，然后通過載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)并使所需要的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，DNA重組技術(shù)涉及核酸分子雜交技術(shù)、PCR反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶等工具酶的應(yīng)用、基因轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)技術(shù)方法，本文就該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中的應(yīng)用作一綜述。

重組DNA技術(shù)屬于遺傳工程分子水平的遺傳操作，是一種按照人的意志定向改變生物遺傳性狀的技術(shù)。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞水平的遺傳操作(稱為細(xì)胞工程)和分子水平的遺傳操作(稱為重組DNA技術(shù))。狹義的遺傳工程就是重組DNA技術(shù)[1]，重組DNA技術(shù)是在體外重新組合DNA分子(脫氧核糖核酸)，并使其在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中增殖的遺傳操作，這種操作可將特定的基因組合到載體上，并使其在受體細(xì)胞中增殖和表達(dá)。因此，它不受親緣關(guān)系限制，為分子遺傳學(xué)和育種學(xué)以及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究開辟了嶄新途徑。

1 重組DNA技術(shù)基本過程

1.1 用入工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，基因可被分離出來[2]。例如，從大腸桿菌中可將乳糖發(fā)酵基因分離出來。先利用兩種有差異的親緣關(guān)系相近的溫和噬菌體分別感染兩類大腸桿菌，噬菌體的DNA可與大腸桿菌的染色體發(fā)生整合。整合位置恰好都在含乳糖發(fā)酵基因DNA片段，但方向相反，整合到大腸桿菌中的噬菌體DNA得到復(fù)制，用紫外線刺激大腸桿菌，使帶乳糖發(fā)酵基因的噬菌體，DNA可以從大腸桿菌染色體中脫出，形成帶乳糖發(fā)酵基因的噬菌體。兩種親緣關(guān)系相近的溫和噬菌體，通過加熱使其DNA片段雙鏈分開，形成單鏈DNA。進(jìn)一步將兩種噬菌體DNA單鏈混合在一起，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，互補(bǔ)的堿基配對(duì)成雙鏈，不能配對(duì)的為單鏈。然后，用外切酶把單鏈DNA切斷，單鏈被分解，保留了雙鏈乳糖發(fā)酵基因。

基因的合成主要有化學(xué)合成和酶促合成兩種方法。（1）化學(xué)合成：例如胰島素，已知胰島素分子由51個(gè)氨基酸組成，它可分為A鏈和B鏈，A鏈由21個(gè)氨基酸組成，B鏈由30個(gè)氨基酸組成，可用遺傳密碼推導(dǎo)出決定A、B鏈DNA上的堿基對(duì)排列進(jìn)行入工合成。（2）酶促合成是利用限制性內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶獲得DNA基因片段的方法。目前已從微生物中提純出600多種限制性內(nèi)切酶，其中常用的只有數(shù)十種，用這種酶可獲得目的基因。真核生物，特別是高等動(dòng)物和植物的結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)的“間斷基因”，即DNA可以在內(nèi)切酶作用下被切斷，無編碼意義的內(nèi)含子被酶分解；而有編碼意義的外顯子由連接酶連接并轉(zhuǎn)錄為mRNA，可利用逆轉(zhuǎn)錄酶得到有關(guān)的cDNA基因片段。這種基因片段，是不含內(nèi)含子而只有外顯子的cDNA。例如兔血紅蛋白基因提取，就是利用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于mRNA取得相應(yīng)cDNA[2]。用上述方法也可以得到胰島素、絲心蛋白等基因。

1.2 運(yùn)載體的選擇 運(yùn)載體的作用是將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞或能轉(zhuǎn)移染色體上的DNA片段，所以必須能自由出入細(xì)胞，常用的載體有SV40病毒、溫和噬菌體和質(zhì)粒等，但最常用的是質(zhì)粒。質(zhì)粒是染色體以外能夠自主復(fù)制的遺傳單元，是由雙鏈DNA分子組成，呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)?？梢杂坞x于細(xì)胞漿中，也可與染色體整合在一起，沒有蛋白質(zhì)外套，是裸露的DNA分子，比染色體小，只帶數(shù)個(gè)或數(shù)10個(gè)基因，最大的也只有大約100個(gè)基因，上面有一個(gè)位點(diǎn)稱為原點(diǎn)，可以攜帶染色體轉(zhuǎn)移。

1.3 質(zhì)粒的分離與重組DNA 用溶菌酶裂解菌細(xì)胞分離出質(zhì)粒。用內(nèi)切酶處理質(zhì)粒，使其DNA在一定位置上斷裂，并在斷裂口出現(xiàn)粘性末端。用同樣的內(nèi)切酶處理分離出的目的基因的DNA，使之具有相同的粘性末端與質(zhì)粒粘性末端相連接，形成重組DNA穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。將重組DNA導(dǎo)入不含質(zhì)粒的細(xì)菌，即受體細(xì)菌中，例如大腸桿菌中，目的基因能隨質(zhì)粒復(fù)制而復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而擴(kuò)增，形成這一基因的無性繁殖系重組DNA克隆化。

1.4 重組DNA的表達(dá) 在加入適量四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上，例如抗四環(huán)素基因的質(zhì)粒十胰島素基因的重組DNA，可以在大腸桿菌中復(fù)制，擴(kuò)增產(chǎn)生大量胰島素。

2 核酸分子雜交技術(shù)及PCR反應(yīng)在動(dòng)物科學(xué)中的應(yīng)用

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測(cè) 傳統(tǒng)的方法多是以免疫學(xué)方法檢測(cè)病原體抗原及其在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，或者使用不同的方法分離培養(yǎng)微生物，有時(shí)存在靈敏度特異性低及速度慢等問題，有的病原體侵入機(jī)體后需潛伏一定時(shí)間后才出現(xiàn)抗體，用免疫學(xué)方法很難及時(shí)檢測(cè)出來，一些持續(xù)感染卻不能積極產(chǎn)生病毒顆粒的病毒，通過檢測(cè)抗原的方法，難以檢測(cè)到病毒，有的病毒的血清學(xué)檢測(cè)只能確定是否接觸過這種病毒，但不能肯定是否存在現(xiàn)行感染。核酸分子雜交技術(shù)可克服以上不足，并可用于動(dòng)物群體的大量檢測(cè)工作，其靈敏度很高，尤其是PCR反應(yīng)，有時(shí)甚至存在一個(gè)病原體即可檢出，其取材范圍廣，可從動(dòng)物的血、尿、糞便、分泌物、體液、涂片、活檢或尸解標(biāo)本中直接檢測(cè)，也可應(yīng)用組織培養(yǎng)或細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本、組織切片檢測(cè)。同時(shí)，目前已有大量的基因探針、寡核苷酸引物可供檢測(cè)使用，運(yùn)用這些探針、引物進(jìn)行核酸分子雜交、PCR反應(yīng)，可以對(duì)大量的病原體(病毒、細(xì)菌、寄生蟲)進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)病原體方面，已進(jìn)行了EB病毒、狂犬病毒、流行性出血熱病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、輪狀病毒、細(xì)小病毒、腺病毒、慢病毒、鼠沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎支原體、弓形體等的應(yīng)用研究[3，4]。YasukoK等對(duì)入工感染鼠肝炎病毒MHV-JHM小鼠的組織進(jìn)行了PCR檢測(cè)，小鼠腹腔接種病毒后僅ld，即可從感染鼠的肝及腦組織中擴(kuò)增出其病毒核酸，而以ELISA法進(jìn)行MHV抗體的檢測(cè)，在接種后6d仍呈陰性，表明PCR是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠肝炎病毒檢測(cè)的敏感方法[5]。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)檢測(cè) 在生物進(jìn)化過程中，由于各種原因引起DNA內(nèi)核苷酸排列順序改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，利用限制性內(nèi)切酶可將DNA切割成不同長度的限制性片段。這些具有不同長度的限制性片段類型在人或動(dòng)物群體中所呈現(xiàn)的多態(tài)分布現(xiàn)象就稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。RFLP在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳孕研究中具有重要作用，可以據(jù)此繪制各品系動(dòng)物的基因組限制性內(nèi)切酶圖譜，以研究各品系動(dòng)物的起源、分化和血緣關(guān)系。史順娣和王昔舟等分別對(duì)KM小鼠及我國自行培育的三種近交系小鼠(TA1、TA2、615)的線粒體DNA(mt DNA)進(jìn)行了酶切電泳分析，其結(jié)果顯示KM、TA1、TA2、615與DBA/2，C67BL/6的mt DNA內(nèi)切酶圖譜一致，表明它們具有相同的起源，即起源于歐州的野鼠Mus musculus domesticus[6,7]。引入注目的是DNA指紋分析法的出現(xiàn)使得RFLP的原理在近郊系動(dòng)物品系的遺傳學(xué)純度及遺傳學(xué)質(zhì)量檢測(cè)中得以應(yīng)用。1985年英國遺傳學(xué)家Jeffery等入在入體基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了高度可變的小衛(wèi)星區(qū)域，這些小衛(wèi)星DNA的高可變區(qū)是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列組成，其核心序列同源性很高，高可變區(qū)的一長度由于串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，這樣的重復(fù)序列被命名為VNTR(Variable number of tandem repeat)，串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的不同，酶切割DNA的片段長度也不同，這些片斷經(jīng)小衛(wèi)星DNA探針進(jìn)行southern雜交后顯示出豐富的RFLP。同一個(gè)體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個(gè)體之間(除非同卵雙生)譜帶都不相同，如同入的指紋具有高度個(gè)體特異性一樣。因此，這種southern雜交圖被稱為DNA指紋(finger pint)[7,8]。此項(xiàng)技術(shù)首先在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用于親子鑒定及罪犯的確認(rèn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)序列也存在于其它哺乳類動(dòng)物基因組，且其核心順序高度同源，這就為在品系內(nèi)具有個(gè)體間基因型一致性的近交系動(dòng)物遺傳純度檢測(cè)提供了理論依據(jù)。Rbert J.Russell等利用DNA指紋分析對(duì)近交系大、小鼠進(jìn)行了遺傳學(xué)檢測(cè)。其方法為從各品系動(dòng)物的尾尖或肝提取DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，利用入源性的小衛(wèi)星DNA核心順序33.6作為探針，以Southern法進(jìn)行雜交，其結(jié)果12個(gè)近交系大鼠品系均有自己獨(dú)特的DNA指紋，而同一品系內(nèi)各個(gè)體的DNA指紋相同。經(jīng)生化標(biāo)志物檢測(cè)證實(shí)發(fā)生了遺傳污染的近交系大鼠Lou/IaP的DNA指紋呈現(xiàn)變異。小鼠近交系品系間也具有自己獨(dú)特的品系 DNA指紋，一些同源近交系間的DNA指紋可相互區(qū)別，但C57BL/6與CBA/ca的雜交F1的DNA指紋不能與C57BL/6區(qū)別。通過生化標(biāo)志檢測(cè)未能檢測(cè)到疑為發(fā)生了遺傳污染的MRI/MP-lpr小鼠的遺傳變異，經(jīng)DNA指紋分析后清楚地證實(shí)了其遺傳污染。Tetsuo kunieda等利用人肌紅蛋白小衛(wèi)星DNA核心序列(MYO)作為探針，對(duì)近交系大鼠進(jìn)行了DNA指紋分析，結(jié)果表明15個(gè)近交系大鼠品系間的DNA指紋完全不同，而同一品系內(nèi)不同個(gè)體的DNA指紋完全相同。來源于同一品系內(nèi)的兩個(gè)亞系的DNA指紋也相同，表明動(dòng)物經(jīng)歷數(shù)代繁殖后，DNA指紋仍呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定。根據(jù)上述研究結(jié)果，研究者認(rèn)為DNA指紋分析是近交系動(dòng)物遺傳學(xué)檢測(cè)的一種簡單、快速、有用的新型檢測(cè)方法，具有良好的應(yīng)用前景[11]。

3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

基因轉(zhuǎn)移是用物理的、化學(xué)的、生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之表達(dá)的一種技術(shù)，它包括體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移及生殖細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移，后者即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立，故轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenic animal)是指那些在其基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合進(jìn)以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立的技術(shù)過程依次為。分離編碼某一目的產(chǎn)物的基因，或者分離對(duì)動(dòng)物表型有作用的某一基因；制備DNA重組子使其能在選定的組織內(nèi)表達(dá)，從而繞過正常存在于動(dòng)物機(jī)體的代謝過程；將DNA重組子在體外轉(zhuǎn)移至一個(gè)剛剛受精的單細(xì)胞卵中(導(dǎo)入方法包括微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載入法、電轉(zhuǎn)移法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法)；經(jīng)處理的卵重新植入適當(dāng)?shù)氖荏w中；子代性狀的分析[12]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究雖然只有10多年的歷史，但它取得的成就已舉世公認(rèn)，并越來越受到重視，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究與不同學(xué)科的結(jié)合，開創(chuàng)了許多具有重大理論和應(yīng)用價(jià)值的研究方向，解決了一些其它技術(shù)所不能解決的問題。下面列舉幾個(gè)方面來闡述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的意義及應(yīng)用情況：（1）基因表達(dá)與調(diào)控；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為基因發(fā)育階段性表達(dá)和組織特異性表達(dá)提供了一個(gè)極好的實(shí)驗(yàn)體系，將不同的基因片段重組子注射入受精卵，研究其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的整合表達(dá)，對(duì)證實(shí)某些DNA序列的作用是非常有用的手段[13]。（2）免疫學(xué)研究：利用轉(zhuǎn)入19基因小鼠制備入單抗，使我們?cè)谥苽淙雴慰箷r(shí)，不受抗原免疫的限制：導(dǎo)入人MHC基因?yàn)檠芯康贗類和第II類組織相容性抗原的功能提供了新的手段[14]。（3）人類疾病模型的建立：如轉(zhuǎn)入人Huntington舞蹈病基因的小鼠，可以產(chǎn)生舞蹈?。粚PV(DNA腫瘤病毒)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中誘發(fā)了皮膚癌；用癌基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)腫瘤，致瘤性可轉(zhuǎn)遞給后代；用乙型肝炎病毒基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠組織中表達(dá)HBsAg mRNA；用HIV基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)HIV抗體、HIVg120外膜蛋白及逆轉(zhuǎn)錄酶等[15,16]。（4）動(dòng)物優(yōu)良品種的培育：將優(yōu)良性狀的基因?qū)雱?dòng)物生殖系，開辟了培育優(yōu)良動(dòng)物新品種的新途徑。當(dāng)首次將生長激素基因?qū)胄∈?，得到了比原來個(gè)體大幾倍的“超級(jí)小鼠”時(shí)[17]，也許人們就認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在遺傳育種方面的劃時(shí)代約意義。目前已經(jīng)得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物除小鼠外，還有轉(zhuǎn)基因兔、羊、豬等，我國水生生物研究所朱作言等將人生長激素基因轉(zhuǎn)入到魚受精卵后，得到了轉(zhuǎn)基因魚，其個(gè)體比對(duì)照組有顯著增加[19,20]。（5）作為生物反應(yīng)器：在發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體液或血液中收獲基因產(chǎn)物，即所謂的“生物反應(yīng)器”，如t-PA(纖溶酶原激活因子)是治療血栓的一種有效藥物，Westpllal等將該蛋白的基因修飾后，在建立的轉(zhuǎn)基因小鼠分泌的乳汁中，檢測(cè)到了人t-PA，除t-PA外，因子XII和a1抗胰蛋白酶也在轉(zhuǎn)基因綿羊奶中得到了表達(dá)，羊奶的重要成份β－乳球蛋白也在其轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中表達(dá)[21]。

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（2012–09–20）

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1007-1733(2012)12-0090-03