劉艷紅，李詠梅

(1淄博齊都醫(yī)院，山東淄博 255400;2淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院)

手足口病傳染性強(qiáng)，傳播途徑復(fù)雜，傳播速度快，短期內(nèi)即可造成大流行。我國(guó)衛(wèi)生部于2008年5月起將其列為丙類傳染病。實(shí)驗(yàn)室檢查為手足口病的主要診斷方法，現(xiàn)概述如下。

手足口病病毒的特征:手足口病的病原體屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組(CoxA)的 2、4、5、7、9、10、16 型，B 組(CoxB)的 1、2、3、4、5 型，腸道病毒 71 型(EV71)，?？刹《?ECHO)等;以EV71和CAV16型最為常見(jiàn)。病毒無(wú)包膜，濕、熱條件適宜生存及傳播，4℃可存活1 a，－20℃可長(zhǎng)期保持感染性。病毒對(duì)紫外線及干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛或56℃、30 min均能將其滅活;但其對(duì)乙醚、75%乙醇、表面活性劑等均不敏感。

手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法:實(shí)驗(yàn)室確診手足口病的標(biāo)準(zhǔn)為從疑似患者的各種分泌物、體液及組織中分離出腸道病毒和檢測(cè)到病毒的特異性核酸;血清標(biāo)本中檢測(cè)到人腸道病毒的特異性中和抗體滴度≥1∶256;或急性期與恢復(fù)期血清中腸道病毒特異性抗體有4倍或4倍以上升高。主要方法:①病毒分離。糞便標(biāo)本是最常采集的標(biāo)本，其他包括咽拭子或咽喉洗液、腦脊液、皰疹液或血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。病毒分離培養(yǎng)對(duì)流行病學(xué)分析具有重要意義，但分離耗時(shí)(4～5 d)。病毒分離培養(yǎng)對(duì)技術(shù)要求較高，費(fèi)用較貴，時(shí)間長(zhǎng)，不適用于流行期間同時(shí)處理大量樣本。②血清學(xué)檢測(cè)。主要包括ELISA、中和抗體試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)。手足口病爆發(fā)流行時(shí)血清學(xué)檢測(cè)不易區(qū)分EV71和CoxA16，只能通過(guò)核苷酸序列測(cè)定進(jìn)行區(qū)分。ELISA法:主要用于檢測(cè)病毒IgM和IgG抗體。特點(diǎn)是快速、經(jīng)濟(jì)、對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求不高。檢測(cè)人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度時(shí)通常需用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度≥4倍增高證明病毒感染。因病毒感染后出現(xiàn)抗體需要一定時(shí)間，故ELISA法的早期診斷靈敏度不高。生物素—親和素酶聯(lián)免疫(BA-ELISA)法以抗EV71抗體為包被抗體，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及精密性均較高。中和試驗(yàn):指將健康人或患者血清與標(biāo)準(zhǔn)腸道病毒株或患者自身分離的病毒株中和，測(cè)定機(jī)體的抗體水平。病毒感染后中和抗體在機(jī)體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，故該法是鑒定病毒的可靠方法，一定程度上還可反映機(jī)體的免疫力。如果中和實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)凝集，樣本中有多個(gè)病毒會(huì)出現(xiàn)抗原漂移，影響抗原分型;接觸病毒機(jī)會(huì)較多者亦容易出現(xiàn)抗體滴度的異常增高而混淆診斷。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn):補(bǔ)體結(jié)合抗體出現(xiàn)在感染早期，可鑒別近期感染或既往感染，由于血清與不同的EV型存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果相對(duì)較高。③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。該技術(shù)幾乎可檢出病毒所有的血清型，與傳統(tǒng)方法相比敏感性、特異性和檢出率均較高。a轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR):檢測(cè)時(shí)需將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行特異DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)。該技術(shù)克服了病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法相對(duì)繁雜費(fèi)時(shí)，且在病毒流行期間無(wú)法滿足同時(shí)處理大量樣本的缺點(diǎn)，是腸道病毒感染的快速診斷手段。但其檢測(cè)周期，操作較復(fù)雜，結(jié)果判定過(guò)程復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)物污染率高。b實(shí)時(shí)熒光PCR:與常規(guī)PCR相比特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、污染率低，目前為手足口病的首選檢查方法。c內(nèi)標(biāo)多重?zé)晒釸T-PCR:該法結(jié)果可靠，能同時(shí)檢測(cè)EV71和CoxA16且檢出率明顯高于傳統(tǒng)方法。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，該法存在假陰性現(xiàn)象，提示有傳統(tǒng)PCR抑制物的存在。④基因芯片技術(shù)。該技術(shù)是將DNA片段高密度的固化到經(jīng)特殊處理的載體表面，在特定條件下與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，然后通過(guò)顯微或掃描技術(shù)收集雜交信號(hào)，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析，從而獲得樣品的遺傳信息，主要優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多段基因，靈敏度較高;應(yīng)用多組探針聯(lián)合判斷檢測(cè)結(jié)果可有效降低假陽(yáng)性率。此外，因基因芯片本身具備高通量、大規(guī)模的特點(diǎn)，用于鑒別診斷最有優(yōu)勢(shì)，可將多種病原體點(diǎn)樣到芯片上進(jìn)行聯(lián)合診斷，從而確診及排除疑似患者。

總之，病毒分離鑒定及血清型分型是檢測(cè)EV71和CoxA16的金標(biāo)準(zhǔn)，但病毒分離鑒定方法繁雜費(fèi)時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)方法靈敏度不高。PCR法，尤其是多重?zé)晒釸T-PCR法靈敏度高，特異性好，可靠性強(qiáng)。