(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率較高，主要原因是發(fā)現(xiàn)時即已有癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。茶多酚是茶葉中三十多種多酚類物質(zhì)的總稱，是一種從綠茶中提取的純天然混合物，主要由四大類物質(zhì)組成，其中以兒茶素最為重要，占多酚類總量的60% ～80%，兒茶素類主要由表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等幾種單體組成，其中以EGCG的含量最豐富。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在體內(nèi)外對許多腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用［1～5］，但是對胃癌細(xì)胞侵襲研究甚少，抗癌機(jī)制亦不完全清楚。2012年1～3月，我們觀察了EGCG對人胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG(Sigma公司)，用二甲基亞砜(DMSO)配成儲液，－20℃冰箱保存;實(shí)驗(yàn)時用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，DMSO的最終濃度＜0.9%;人胃癌BGC823細(xì)胞株，本院組織細(xì)胞生物庫凍存，購自中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫;Trizol試劑購自Invitrogen公司;BCA蛋白分析試劑盒購自Pierce公司;基底膜膠購自BD公司。RPMI1640、新生小牛血清均購自Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人胃癌BGC823細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640液中，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察，待細(xì)胞至對數(shù)生長期，實(shí)驗(yàn)組加入20、40、80 μmol/L 的 EGCG 處理，對照組以RPMI1640代替EGCG處理細(xì)胞，備測。

1.2.2 細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕法。先用marker筆在6孔板背后，均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。取對數(shù)生長期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，使用培養(yǎng)基配制成濃度為8×105個/mL的細(xì)胞懸液，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細(xì)胞鋪滿單層。用100 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕;用槍頭盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入1 000 μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組;6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍照。記錄細(xì)胞遷移距離。

1.2.3 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。上下室之間鋪聚碳酸醋微孔濾膜(孔徑8 μm)，濾膜上包被有Matrigel。制備ECM gel小室:將ECM gel置于4℃預(yù)冷2 h，Transwell小室上室加入ECM gel 50 μl，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)直至 ECM gel凝固為止。制備細(xì)胞懸液:撤去血清饑餓細(xì)胞24 h，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含0.1%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。下室加入500 μL含20%FBS和相應(yīng)濃度Endostar的培養(yǎng)基，上室加入100 μL密度為1×106個/mL的細(xì)胞懸液，ECM gel小室置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h。擦去小室上表面細(xì)胞，24孔板中每孔加入0.5 mg/mL的MTT 500 μL，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 4 h后取出，每孔加入 DMSO 500 μL，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使甲臜充分溶解。取出小室，將DMSO移到96孔板中，每孔100 μL，于酶標(biāo)儀上490 nm處讀取OD值，按照以下公式計(jì)算侵襲率。侵襲率=(測定組OD值－空白對照組OD值)/(遷移組OD值－空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 cripto基因蛋白檢測 采用免疫熒光法。將胃癌細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞和蓋玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加 cripto單克隆抗體(1∶2 000)覆蓋整個切片，4℃過夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，37℃保溫30 min。PBS振洗2次后用蒸餾水振洗。50%緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，熒光強(qiáng)度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遷移能力 對照組及實(shí)驗(yàn)組不同濃度(20、40、80 μmol/L)細(xì)胞遷移距離分別為(420 ±15)、(278±12)、(189±11)、(112±8)μm，細(xì)胞遷移距離呈濃度依賴性減少(P均＜0.001)。

2.2 細(xì)胞侵襲能力 對照組及實(shí)驗(yàn)組不同濃度(20、40、80 μmol/L) 細(xì)胞穿過濾膜的細(xì)胞分別為(38.6 ±1.5)、(28.2 ±1.8)、(15.8 ±1.2)、(7.8 ±1.6)個，穿膜細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性減少(P均 ＜0.001)。

2.3 cripto蛋白表達(dá) 對照組及實(shí)驗(yàn)組不同濃度(20、40、80 μmol/L)細(xì)胞 cripto 蛋白表達(dá)量分別為(51.86 ±3.36) ×102、(28.56 ±2.25) ×102、(15.36±3.22) ×102、(8.39 ±2.58) ×102pg，cripto 蛋白表達(dá)呈濃度依賴性減少(P均＜0.05)。

3 討論

已證實(shí)，EGCG對許多腫瘤細(xì)胞生長具有一定的抑制作用［1～6］。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可明顯抑制胃癌細(xì)胞生長增殖，其機(jī)制主要與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［7，8］。但目前EGCG對胃癌細(xì)胞遷移侵襲的研究甚少。

遷移性是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的重要特征之一，在成體組織中大多數(shù)正常細(xì)胞不具有遷移性，活躍遷移的正常細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小腸黏膜上皮細(xì)胞等。而惡性腫瘤細(xì)胞一般具有十分活躍的遷移性。體外培養(yǎng)時，正常細(xì)胞具有遷移的接觸抑制，因而呈單層生長;而癌細(xì)胞喪失了遷移的接觸抑制，從而呈多層重疊生長。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌BGC823細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移性，而經(jīng)EGCG處理后，細(xì)胞遷移能力明顯減弱，且呈劑量依賴性，提示EGCG可以有效地抑制胃癌細(xì)胞遷移。

腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程。一旦腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤上脫落，將侵入宿主的細(xì)胞外基質(zhì)，然后穿透淋巴管和血管，進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在此過程中，腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)是重要的步驟。本研究所用Transwell方法檢測癌細(xì)胞侵襲中所用的基質(zhì)膠含有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖等成分，與細(xì)胞外基質(zhì)成分非常相近。因此，能有效地在體外模擬腫瘤細(xì)胞的侵襲過程。本研究實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲呈濃度依賴性減少，提示EGCG可明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

cripto基因是表皮生長因子重要成員之一，定位在人類染色體 3p21.3［9］，編碼 cripto 蛋白，又稱cripto基因。研究發(fā)現(xiàn)，cripto基因在許多實(shí)體瘤中過度表達(dá)，而正常組織表達(dá)極低或不表達(dá)［10～14］。前期采用免疫組化方法檢測大腸癌相關(guān)組織，發(fā)現(xiàn)cripto基因蛋白過表達(dá)與大腸癌細(xì)胞漿膜侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Duke分期密切相關(guān)，而與大腸癌分化程度無關(guān)［13］。提示cripto基因與大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞cripto蛋白表達(dá)呈濃度依賴性減少，提示cripto基因參與調(diào)控EGCG抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力。

總之，EGCG可明顯抑制胃癌細(xì)胞體外惡性遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與下調(diào)cripto基因表達(dá)有關(guān)。

［1］Kato K，Long NK，Makita H，et al.Effects of green tea polyphenol on methylation status of RECK gene and cancer cell invasion in oral squamous cell carcinoma cells［J］.Br J Cancer，2008，99(4):647-654.

［2］Kushima Y，Iida K，Nagaoka Y，et al.Inhibitory effect of(-)-epigallocatechin and(-)-epigallocatechin gallate against heregulin beta1-induced migration/invasion of the MCF-7 breast carcinoma cell line［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(5):899-904.

［3］Larsen CA，Dashwood RH.(-)-Epigallocatechin-3-gallate inhibits Met signaling，proliferation，and invasiveness in human colon cancer cells［J］.Arch Biochem Biophys，2010，501(1):52-57.

［4］Sen T，Chatterjee A.Epigallocatechin-3-gallate(EGCG)downregulates EGF-induced MMP-9 in breast cancer cells:involvement of integrin receptor α5β1 in the process［J］.Eur J Nutr，2011，50(6):465-478.

［5］Singh T，Katiyar SK.Green tea catechins reduce invasive potential of human melanoma cells by targeting COX-2，PGE2 receptors and epithelial-to-mesenchymal transition［J］.PLoS One，2011，6(10):e25224.

［6］Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells［J］.World J Gastroenterol，2008，14(3):428-434.

［7］姚靜靜，王琪，齊曉光，等.EGCG對低氧誘導(dǎo)下胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(10):1199-1203.

［8］譚曉華，張亞，周殿元.EGCG誘導(dǎo)胃癌和肝癌細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)下調(diào)的研究［J］.癌癥，2000，19(7):8-11.

［9］Nagaoka T，Karasawa H，Castro NP，et al.An evolving web of signaling networks regulated by Cripto-1［J］.Growth Factors，2012，30(1):13-21.

［10］De Luca A，Lamura L，Strizzi L，et al.Expression and functional role of Cripto-1 in cutaneous melanoma［J］.Br J Cancer，2011，105(7):1030-1038.

［11］Hong SP，Lee EK，Park JY，et al.Cripto-1 overexpression is involved in the tumorigenesis of gastric-type and pancreatobiliary-type intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas［J］.Oncol Rep，2009，21(1):19-24.

［12］Bianco C，Strizzi L，Mancino M，et al.Regulation of Cripto-1 signaling and biological activity by caveolin-1 in mammary epithelial cells［J］.Am J Pathol，2008，172(2):345-357.

［13］范鈺，張尤歷，吳鶯，等.大腸癌組織畸胎瘤衍生生長因子1蛋白表達(dá)及臨床意義［J］.中華消化內(nèi)鏡雜志，2007，12(6):401-402.

［14］范鈺，鄭樹，丁佳逸.脂質(zhì)體介導(dǎo)的cripto反義寡核苷酸抑制結(jié)腸癌細(xì)胞端粒酶活性［J］.中國病理生理雜志，2006，22(4):761-765.