范洪君綜述 劉風(fēng)玲審校

循環(huán)核酸是指存在于血漿或血清等體液中的細(xì)胞外游離狀態(tài)的核酸。早在1948年，Mandel與Métais[1]首次發(fā)現(xiàn)了人類血液中循環(huán)核酸的存在，但當(dāng)時并未引起學(xué)術(shù)界太大的關(guān)注。直到1994年，腫瘤患者血液中RAS基因片段的檢測及應(yīng)用[2]，醫(yī)學(xué)界才重新認(rèn)識到循環(huán)核酸的重要性。鑒于循環(huán)核酸在腫瘤無創(chuàng)診斷及連續(xù)檢測等方面的優(yōu)勢，它正逐漸成為國內(nèi)外腫瘤學(xué)界研究的熱點。

1 循環(huán)核酸的組成及發(fā)現(xiàn)

1.1 循環(huán)DNA

1966年，Tan等[3]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了高水平的游離循環(huán)DNA，之后在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、肝炎和癌癥等患者體內(nèi)也檢測到了高水平的循環(huán)DNA。1989年Stroun等[4]從多種癌癥患者血漿中抽提純化DNA,發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)荷較大的晚期惡性腫瘤患者體內(nèi)可檢測到循環(huán)DNA，并首次揭示了循環(huán)DNA可能具有腫瘤DNA的某些特征。1994年，癌癥患者血漿DNA中檢測出N- ras等癌基因突變[2]。1996年，Chen[5]和Nawroz[6]同時報道了腫瘤患者血液中存在微衛(wèi)星改變,且同腫瘤原發(fā)灶中微衛(wèi)星改變一致。從此，循環(huán)DNA的研究進入了嶄新的階段。

目前研究認(rèn)為，循環(huán)DNA主要來自腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞的凋亡、壞死及腫瘤組織的分泌，壞死及凋亡的腫瘤細(xì)胞通常被巨噬細(xì)胞所吞噬，并將消化后的核酸釋放到腫瘤組織環(huán)境中去[7]。此外，血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及骨髓、肝臟等轉(zhuǎn)移灶也是循環(huán)DNA的來源[8,9]。在其檢測方面，熒光染色法及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(如SYBR Green和TaqMan探針)等多種方法可對循環(huán)DNA進行測定。

1.2 循環(huán)mRNA

1979年，Hamilton等[10]在健康人和多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中分離到循環(huán)RNA分子，第1次較準(zhǔn)確地定量了血漿RNA水平。然而，血液中含有豐富的RNA酶且RNA分子極不穩(wěn)定，因此循環(huán)RNA理論一開始并未得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。直到1999年，Kopreski等[11]在惡性黑色素瘤患者血漿中檢測到腫瘤細(xì)胞來源的mRNA分子才開創(chuàng)了循環(huán)mRNA用于腫瘤分子診斷領(lǐng)域。

目前對循環(huán)mRNA來源的研究認(rèn)為，mRNA可以與蛋白質(zhì)及脂類等結(jié)合而不被降解，最終由細(xì)胞表面脫落入血[12,13]。微列陣技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR技術(shù)常用于其檢測。

1.3 循環(huán)miRNA

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼小RNA，能在轉(zhuǎn)錄后或者在翻譯水平上影響基因表達。大約50%的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(fragile site)，這說明miRNA可能在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。miRNA具有調(diào)控細(xì)胞周期、分化細(xì)胞等基本功能，參與機體的生長發(fā)育及疾病的發(fā)生與發(fā)展。此外，miRNA在造血細(xì)胞分化發(fā)育、免疫細(xì)胞功能和腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。

1993年，Lee等[14]在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了小分子非編碼RNA：Lin4。2000年，Reinhart等[15]又發(fā)現(xiàn)了具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA：Let-7。2008年，來自牛津大學(xué)的Lawrie等[16]在慢性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血清中檢測到了miR-21，并發(fā)現(xiàn)miR-21與患者無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)，從而開創(chuàng)性的將循環(huán)miRNA引入腫瘤領(lǐng)域。

循環(huán)miRNA是通過神經(jīng)酰胺依賴的分泌機制，從細(xì)胞中釋放，并包埋在脂質(zhì)或脂蛋白復(fù)合物，如凋亡小體、微泡及外切體中[17,18]。由于miRNA體積極小并與脂質(zhì)及蛋白質(zhì)附著，高效率及可重復(fù)抽提仍然是目前研究的主要困難。目前，實時熒光定量PCR技術(shù)仍是定量檢測循環(huán)miRNA的主要方法。

2 循環(huán)核酸的應(yīng)用及研究熱點

檢測患者血液中循環(huán)核酸以避免腫瘤組織活檢，這將在腫瘤無創(chuàng)診斷領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。定期復(fù)查患者血液中循環(huán)核酸，為及時發(fā)現(xiàn)患者病情進展與療效評價提供了1種嶄新的手段。目前，對循環(huán)DNA領(lǐng)域的研究主要集中在微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失、癌基因突變、基因多態(tài)性及甲基化方面；循環(huán)mRNA領(lǐng)域則集中在酪氨酸酶mRNA、端粒酶成分及不同腫瘤相關(guān)基因編碼的mRNA；而循環(huán)miRNA領(lǐng)域集中在發(fā)現(xiàn)癌組織中特異表達的miRNAs及找出腫瘤各期差異的miRNAs，從而完成對腫瘤的診斷和分期。

3 循環(huán)核酸與癌癥

3.1 乳腺癌

Sharma等[19]對100例乳腺癌患者腫瘤組織中和血清中BRCA1、MGMT及GSTP1啟動子甲基化檢測，證實了血清中DNA甲基化檢測可代替腫瘤組織檢測，血清中DNA甲基化可作為乳腺癌診斷及預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物。Heneghan等[20]通過實時定量PCR法對163例癌癥患者(包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎癌及惡性黑色素瘤)和63例健康人的血液進行檢測，證實循環(huán)miR-195對乳腺癌診斷的敏感度和特異度分別為88%和91%，聯(lián)合循環(huán)let-7a、miR-10b對乳腺癌診斷的有效率增至94%。因此，循環(huán)核酸可作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物。

Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中miR-21、miR-106a與miR-155表達升高，而miR-126、miR-199a與miR-335表達下調(diào)，進一步分析顯示miR-21、miR-126、miR-155、miR-199a及miR-335與腫瘤分期及雌孕激素受體表達相關(guān)。Heneghan等[22]研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌術(shù)后患者血液中循環(huán)miR-195和let-7a顯著下降，并且兩者與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER表達相關(guān)。以上研究結(jié)果提示，循環(huán)核酸不僅與乳腺癌分期相關(guān)，還與激素受體表達情況關(guān)聯(lián)。

來自丹麥Sorensen等[23]的研究證實在接受化療聯(lián)合赫賽汀治療的乳腺癌患者中，治療后血漿HER-2 DNA顯著下降的患者對赫賽汀有更高的反應(yīng)率，并且總生存期顯著延長。賈海明等[24]研究顯示MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA可以作為特異性腫瘤標(biāo)志物用于檢測乳腺癌患者外周血單核細(xì)胞中的乳腺癌細(xì)胞，其檢測結(jié)果可能有助于判斷乳腺癌患者的預(yù)后。以上研究表明，循環(huán)核酸可用于乳腺癌預(yù)后預(yù)測。

3.2 肺癌

在肺癌的診斷及鑒別診斷方面，Zheng等[25]對74例肺癌患者和68例健康者的血漿進行檢測，結(jié)果顯示，血漿中循環(huán)miR-155、miR-197和miR-182在肺癌患者組顯著高于對照組，這3種標(biāo)志物聯(lián)合診斷肺癌的敏感度和特異度分別為81.33%和86.76%，并且miR-155和miR-197在化療有效組治療后顯著下降。Shen等[26]聯(lián)合血液中循環(huán)miR-21、miR-210和miR-486-5p對孤立性肺結(jié)節(jié)良惡性進行鑒別診斷，結(jié)果顯示三者聯(lián)合診斷肺癌的ROC曲線下面積達0.86，診斷肺癌的敏感度和特異度分別為75.00%和84.95%。以上研究顯示，循環(huán)核酸可用于肺癌的診斷與鑒別診斷。

3.3 消化道腫瘤

周儉等[27]利用microRNA芯片和定量RT-PCR法對934個參試者(包括457個乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者，167個健康志愿者，169個慢性病毒性乙型肝炎患者以及141個肝硬化患者)血漿microRNA進行檢測，最后利用7個microRNA組合-miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801診斷肝癌的ROC曲線下面積達0.888，診斷的敏感度和特異度分別為81.8%和83.5%，并且能夠有效區(qū)分肝癌患者與正常人群、慢性病毒性乙型肝炎患者及肝硬化患者。這為肝癌的早期診斷提供了更加經(jīng)濟與簡便的檢測手段。

Arigami等[28]證實B7-H3 mRNA在胃癌患者血液中的表達顯著高于健康人，B7-H3表達情況與總生存相關(guān)，多因素分析顯示B7-H3 mRNA是胃癌預(yù)后獨立預(yù)測因子。Liu等[29]通過Solexa測序法檢測患者血清中miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34和miR-423-5p，其聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線下面積達0.897，顯著優(yōu)于胃癌傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA和CA19-9，并且患者血清中此5種miRNA水平與胃癌分期相關(guān)，因此，聯(lián)合少數(shù)循環(huán)miRNA是較為理想的腫瘤診斷指標(biāo)。Cheng等[30]的研究證實在晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血漿中miR-141是除CEA外的又一預(yù)測標(biāo)志物，而且血漿中miR-141含量越高患者預(yù)后越差。

Komatsu[31]檢測了50例食管鱗癌患者和20例正常人血漿循環(huán)原癌miRNAs(miR-21)和抑癌miRNAs(miR-375)，結(jié)果表明，食管鱗癌中miR-21并未顯著上升而miR-375則顯著下降；將二者聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)miR-21/miR-375的比率顯著升高，其ROC曲線下面積為0.816，診斷食管癌的靈敏度和特異度分別為88%和70%。此外，Morimura等[32]還證實了循環(huán)miR-18a在胰腺癌診斷中的價值。以上研究均顯示了循環(huán)核酸在消化道腫瘤早期診斷、預(yù)后預(yù)測等方面的應(yīng)用價值。

3.4 泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤

Redova等[33]對15例腎細(xì)胞癌患者和12例健康人血清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌患者循環(huán)miR-378和miR-451分別顯著升高和下調(diào)，二者聯(lián)合診斷腎細(xì)胞癌的靈敏度和特異度分別為81%和83%。Zhang等[34]對109例宮頸癌患者、138例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及80例健康人血液循環(huán)Bmi-1 mRNA進行檢測，結(jié)果顯示，循環(huán)Bmi-1 mRNA較宮頸癌傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物SCC-Ag和CA125有更高的準(zhǔn)確性；此外，循環(huán)Bmi-1 mRNA較高的患者無病生存期及總生存期顯著縮短。

3.5 其他腫瘤

Milas等[35]對分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)的研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前96%的DTC患者血液中血清促甲狀腺素受體(TSHR)mRNA >1 ng/μg，而在良性甲狀腺疾病及健康人中卻檢測不到；術(shù)后長期隨訪證實血液中檢測不到TSHR mRNA的DTC患者支持腫瘤尚未復(fù)發(fā)。Shinozaki等[36]在不同分期的惡性黑色素瘤患者中檢測到血清循環(huán)DNA存在BRAF V600E突變，且突變率與分期相關(guān)，該方法還可以用來監(jiān)測正在接受治療的轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤患者的治療療效。2011年8月，美國FDA批準(zhǔn)了vemurafenib用于V600E BRAF突變的晚期黑色素瘤患者，這也使得循環(huán)DNA中BRAF基因突變檢測越來越受到關(guān)注。

總之，目前腫瘤患者的治療依然依賴于早期診斷、合理分期及監(jiān)測病情變化。腫瘤患者組織活檢與血液標(biāo)志物檢測是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但多數(shù)情況下這些評估手段僅應(yīng)用一次。新近研究還證實腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶在基因、遺傳學(xué)及轉(zhuǎn)錄水平存在差異，因此對于那些組織活檢取材不太容易的患者，循環(huán)核酸不僅可以重復(fù)取材而且可以監(jiān)測患者病情的變化，將來可能取代腫瘤組織活檢及腫瘤蛋白標(biāo)志物檢測。

[1] Mandel P,Métais P.Les acides nucl’eiques du plasma sanguin chez l’homme〔J〕.C R Hebd Seances Acad Sci (Paris),1948,142(3～4)：241.

[2] Vasioukhin V,Anker P,Maurice P,et al.Point mutations of the N-ras genein the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia〔J〕.Br J Haematol,1994,86(4)：774.

[3] Tan Eng M,Pierre R.Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus and other disease〔J〕.J Clin Invest,1966,45(11)：1732.

[4] Stroun M,Anker P,Maurice P,et al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients〔J〕.Oncology,1989，46(5)：318.

[5] Chen X Q,Stroun M,Magnenat J L,et al.Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients〔J〕.Nat Med,1996,2(9)：1033.

[6] Nawroz H,Koch W,Anker P,et al.Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients〔J〕.Nat Med,1996,2(9)：1035.

[7] Gahan P B,Anker P,Stroun M.Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA?〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2008,1137(1)：7.

[8] Schwarzenbach H,Alix-Panabières C,Müller I,et al.Cell-free tumor DNA in blood plasma as a marker for circulating tumor cells in prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(3)：1032.

[9] Schwarzenbach H,Chun F K,Lange I,et al.Detection of tumor-specific DNA in blood and bone marrow plasma from patients with prostate cancer〔J〕.Int J Cancer,2007,120(7)：1465.

[10] Hamilton T C,Smith A G,Griffin C A,et al.Ribonucleic acid in plasma from normal adults and multiple myeloma patients〔J〕.Clin Chem,1979,25(10):1774.

[11] Kopreski M S,Benko F A,Kwak L W,et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma〔J〕.Clin Cancer Res,1999,5(8)：1961.

[12] Orozco A F,Lewis D E.Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma〔J〕.Cytometry A,2010,77(6)：502.

[13] Cocucci E,Racchetti G,Meldolesi J,et al.Shedding microvesicles：artefacts no more〔J〕.Trends Cell Biol,2009,19(2)：43.

[14] Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14〔J〕.Cell,1993,75(5)：843.

[15] Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature,2000,403(6772)：901.

[16] Lawrie C H,Gal S,Dunlop H M,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma〔J〕.Br J Haematol,2008,141(5)：672.

[17] Iguchi H,Kosaka N,Ochiya T.Secretory microRNAs as a versatile communication tool〔J〕.Commun Integr Biol,2010,3(5)：478.

[18] Kosaka N,Iguchi H,Yoshioka Y,et al.Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells〔J〕.J Biol Chem,2010,285(23)：17442.

[19] Sharma G,Mirza S,Yang Y H,et al.Prognostic relevance of promoter hypermethylation of multiple genes in breast cancer patients〔J〕.Cell Oncol,2009,31(6)：487.

[20] Heneghan H M,Miller N,Kelly R,et al.Systemic miRNA-195 differentiates breast cancer from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and early stage disease〔J〕.Oncologist,2010,15(7)：673.

[21] Wang F,Zheng Z,Guo J,et al.Correlation and quantitation of microRNA aberrant expression in tissues and sera from patients with breast tumor〔J〕.Gynecol Oncol,2010,119(3)：586.

[22] Heneghan H M,Miller N,Lowery A J,et al.Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer〔J〕.Ann Surg,2010,251(3)：499.

[23] Sorensen B S,Mortensen L S,Andersen J,et al.Circulating HER2 DNA after trastuzumab treatment predicts survival and response in breast cancer〔J〕.Anticancer Res,2010,30(6)：2463.

[24] 賈海明,杜小平,趙慶麗，等.以黑色素瘤抗原基因mRNA為標(biāo)記檢測乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞〔J〕.實用癌癥雜志,2008,23(4)：349.

[25] Zheng D,Haddadin S,Wang Y,et al.Plasma microRNAs as novel biomarkers for early detection of lung cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2011,4(6)：575.

[26] Shen J,Liu Z,Todd N W,et al.Diagnosis of lung cancer in individuals with solitary pulmonary nodules by plasma microRNA biomarkers〔J〕.BMC Cancer,2011,11(1)：374.

[27] Zhou J,Yu L,Gao X,et al.Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma〔J〕.J Clin Oncol,2011,29(36)：4781.

[28] Arigami T,Uenosono Y,Hirata M,et al.B7-H3 expression in gastric cancer：a novel molecular blood marker for detecting circulating tumor cells〔J〕.Cancer Sci,2011,102(5)：1019.

[29] Liu R,Zhang C,Hu Z,et al.A five-microRNA signature identified from genome-wide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric cancer diagnosis〔J〕.Eur J Cancer,2011,47(5)：784.

[30] Cheng H,Zhang L,Cogdell D E,et al.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis〔J〕.PLoS One,2011,6(3)：e17745.

[31] Komatsu S,Ichikawa D,Takeshita H,et al.Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Cancer,2011,105(1)：104.

[32] Morimura R,Komatsu S,Ichikawa D,et al.Novel diagnostic value of circulating miR-18a in plasma of patients with pancreatic cancer〔J〕.Br J Cancer,2011,105(11)：1733.

[33] Redova M,Poprach A,Nekvindova J,et al.Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma〔J〕.J Transl Med,2012,10(1)：55.

[34] Zhang X,Wang C,Wang L,et al.Detection of circulating Bmi-1 mRNA in plasma and its potential diagnostic and prognostic value for uterine cervical cancer〔J〕.Int J Cancer,2012,131(1)：165.

[35] Milas M,Shin J,Gupta M,et al.Circulating thyrotropin receptor mRNA as a novel marker of thyroid cancer：clinical applications learned from 1758 samples〔J〕.Ann Surg,2010,252(4)：643.

[36] Shinozaki M，O'Day S J,Kitago M,et al.Utility of circulating B-RAF DNA mutation in serum for monitoring melanoma patients receiving biochemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res,2007,13(7)：2068.