游建,周巖

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

在轉基因植物中,導入植物體內的外源基因除了目的基因之外,還有選擇標記基因及其他相關基因.目的基因是用來優(yōu)化或賦予植物特定性狀的基因；選擇標記基因則能賦予轉基因植株抗某種抗生素或除草劑等特性,在轉基因過程中的使用可以大大提高轉基因植物篩選的效率.除了目的基因,人們對轉基因植物的擔憂主要集中在標記基因上,盡管還沒有確切的證據證實標記基因確實存在安全隱患,但標記基因的安全性問題已受到世界各國政府和組織的重視,并已成為限制轉基因植物產業(yè)化和商業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸[1].如何刪除標記基因以提高轉基因植物的安全性一直是基因工程研究的熱點之一,研究人員已先后發(fā)展了如共轉化[2]、位點特異性重組系統(tǒng)[3]、轉座子法[4]等手段來刪除轉基因植物中的標記基因,從而提高基因工程中標記基因的安全性,并已取得豐碩成果.位點特異性重組系統(tǒng),由于其在標記基因刪除過程中有較高的刪除效率和刪除精確性,因此在刪除轉基因植物標記基因,獲得無標記基因作物方面發(fā)揮著重要作用[5].近年來,運用位點特異性重組系統(tǒng)在去除水稻、煙草、柑橘等轉基因植物標記基因方面的研究已有大量報道[6-8].來源于啤酒酵母的FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)由于具有較高的刪除效率和刪除精確性,已經被廣泛應用于煙草、擬南芥、水稻等高等真核模式植物的研究中,實現(xiàn)了基因敲除、基因插入、點突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等基因工程操作[9].本文主要就FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)的基本概況及其在植物基因工程中標記基因刪除方面的應用進行概述和評價.

1 FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)概況

FLP/FRT系統(tǒng)來自于啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）細胞內的2 μm雙鏈環(huán)狀DNA質粒.2 μm雙鏈環(huán)結構上最為顯著的特點是存在2個9 bp的反向重復序列.由于2個9 bp的反向重復序列之間可以發(fā)生DNA片段重組,因此,酵母細胞中的2 μm雙鏈環(huán)結構存在2種不同的可以互變的構型,這種行為使得2 μm雙鏈環(huán)在酵母細胞中的能夠維持較高的拷貝數.后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),2 μm雙鏈環(huán)分子內發(fā)生的DNA重組屬于受特異性酶催化的位點特異性重組.1980年,Broach等[10]將催化這一特異性重組反應的由flippase基因編碼的重組酶命名為“FLP”（flippase recombination enzyme）.FLP是特異性重組酶,作用的靶序列為2 μm雙鏈環(huán)的2個反向重復序列中包含有3個13 bp的FLP重組酶結合區(qū)和1個8 bp的含限制性酶切位點的非對稱間隔區(qū)的共48 bp的FRT位點（FLP recombination target）.自1993年Lyznik等[11]利用FLP/FRT系統(tǒng)瞬時轉化玉米和水稻的原生質體以來,FLP/FRT系統(tǒng)已被廣泛應用于煙草、擬南芥、楊樹等高等真核模式植物的研究中,并在實踐中得到不斷的改良和發(fā)展,是目前轉基因動植物研究領域進行基因操作的強有力的工具.FLP/FRT系統(tǒng)在植物基因工程中主要有3個方面的應用：定點轉化植物、刪除標記基因、特定組織器官或發(fā)育時期刪除轉入的外源基因[12].其中,刪除篩選標記基因是FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)的重要應用.

2 FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)在標記基因刪除中的應用

按照工作原理及切除過程的不同,FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)大致可劃分為3種基因刪除方式,即：簡單刪除、控制刪除及高效刪除.

2.1 簡單刪除

簡單刪除是FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)最先采用的刪除方式.研究者首先要構建兩個載體,一個載體上構建有FLP重組酶基因,另一個載體則構建有2個同向的FRT序列,選擇標記基因位于2個同向的FRT序列之間.利用構建好的載體轉化不同植株,獲得分別FLP重組酶基因和2個同向的FRT序列的植株,再將轉化體進行有性雜交,后代經分離獲得無標記基因的植株，或者通過二次轉化的方法刪除篩選標記基因.自從Lyznik[11]等首次利用二次轉化將FLP/FRT系統(tǒng)用于玉米和水稻的原生質體轉化瞬時表達以來,許多研究者對此進行了大量嘗試,并取得了較大成功.Kerbach等[13]于2005年通過有性雜交的方式首次將FLP/FRT系統(tǒng)引入到玉米植株中,但是在轉基因后代中檢測到的刪除效率很低,7株雜交后代僅有1株檢測到了刪除事件的發(fā)生.單曉映等[14]利用二次轉化的方法分別將兩側含有FRT位點的乙酰乳酸合成酶als基因作選擇標記基因和含有由熱誘導啟動子hsp70控制的FLP重組酶基因轉入煙草中,獲得了煙草轉化植株,建立了可在植物中廣泛應用的FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng).熱激處理誘導熱誘導型啟動子hsp70調控的重組酶FLP基因的表達后,獲得了41%的二次轉化植株選擇標記基因als的有效刪除率.Hu等[6]則將構建含有卡那霉素抗性基因（nptⅡ）和gus報告基因的水稻品系與含有編碼FLP重組酶基因的水稻品系通過有性雜交獲得了無卡那霉素抗性標記基因的轉基因水稻,F1代水稻植株體內FLP介導的卡那霉素抗性標記基因刪除效率達到了25.6%,實現(xiàn)了標記基因的有效刪除.Li等[15]首先將擬南芥中能提高植物耐堿性的Na+/H+反向運輸蛋白基因AtNHX1轉入玉米基因組,獲得了含有反向運輸蛋白基因AtNHX1和乙酰乳酸合成酶標記基因als的轉基因玉米.通過與轉化FLP重組酶基因的轉基因玉米雜交,雜交F1代能有效利用FLP/FRT系統(tǒng)刪除乙酰乳酸合成酶選擇標記基因,刪除效率達到40.7%,同樣實現(xiàn)了標記基因的有效刪除.

通過二次轉化FLP重組酶基因或與轉化FLP重組酶基因的轉化植株進行有性雜交從而引入重組酶基因來實現(xiàn)標記基因的刪除,轉化植株需要進行自交分離篩選無重組酶基因以及轉化重組酶基因時帶入的另一個選擇標記基因,使得無選擇標記基因轉基因后代選育周期過長.另外,二次轉化首先需要建立一個高效的遺傳再生體系.然而,對于轉基因困難的作物來說由于其較低的轉化效率,限制了二次轉化的應用.此外,有性雜交方法也不適合無性繁殖作物.無論是二次轉化還是有性雜交的方式引入重組酶基因轉入由于其工作量大,周期長,刪除效率低,不受人為控制,標記基因的刪除效率不高等缺陷限制了其在植物遺傳改良中的應用.

2.2 可控刪除

通過簡單刪除方式需要通過后代自交分離進一步去掉重組酶基因及轉化重組酶基因時所帶入的另一個選擇標記基因,使得無選擇標記轉基因作物的選育周期過長,刪除效率不高,且受體范圍只局限于有性生殖的植物.針對以上不足,研究人員發(fā)展了新的標記基因控制刪除技術即將FLP重組酶基因和目的基因、FRT位點、選擇標記基因等都構建到同一個植物表達載體上,將要刪除的選擇標記基因和FLP重組酶基因置于2個同向的FRT位點間,采用特異性啟動子,如化學誘導或熱誘導等誘導型啟動子、種子或花等組織特異性啟動子等,來啟動FLP重組酶基因的表達,實現(xiàn)目的基因的刪除[16].自從Kilby等[17]首次采用大豆熱激蛋白基因啟動子Gmhsp17.6-L實現(xiàn)了對重組酶FLP基因表達的可控性誘導后,利用各種誘導型啟動子控制誘導重組酶基因的表達,從而實現(xiàn)對轉基因植物選擇標記基因進行時空可控性刪除日益受到研究人員的親睞[9].Deng等[18]利用構建的含有置于2個同向的FRT位點間的重組酶FLP基因和轉錄因子基因（babyboom,BBM）的載體pLFFP-BBM轉化中國毛白楊.其中,重組酶FLP基因由熱激誘導啟動子HSP18.2控制，BBM由35S啟動子驅動.在毛白楊的體細胞胚胎建成過程中,BBM的過量表達使得毛白楊的體細胞胚能夠再生出表型變異的轉基因植株,經過熱激處理誘導重組酶的表達,使得BBM被刪除,從而植株表型恢復正常.體細胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)可以在不使用任何選擇劑的情況下,利用體細胞胚再生無標記轉基因植株.Woo等[19]利用多重脅迫誘導的過氧化物酶（POD）啟動子誘導FLP重組酶表達,在附加有過氧化氫的條件下,刪除了轉基因煙草中作為選擇標記的潮霉素磷酸轉移酶hpt基因,獲得的F1代轉基因植株中選擇標記基因的刪除效率最高可達41%.Fladung[20]利用構建的含有置于2個同向的FRT位點間大豆熱誘導啟動子HSP17.5-E驅動的重組酶FLP基因和35S啟動子驅動的nptⅡ基因的載體pTex轉化山楊.經過熱激誘導,65.2%的轉化再生植株成功地刪除了FLP和nptⅡ基因.有研究者同樣研究了FLP/FRT系統(tǒng)在楊樹遺傳改良中進行篩選標記基因移除和目的基因轉移中的可行性,其研究結論顯示FLP/FRT系統(tǒng)可以在楊樹中介導高效的篩選標記移除和進行精確的基因定向整合.從理論上說,由于熱激處理等誘導處理轉基因植物的時間和頻率都可以人為控制,故可以自由控制轉基因植物中外源基因的刪除.但是,如果將其應用于大田大規(guī)模種植的轉基因作物去解決轉基因安全性等問題,仍然存在可操作性以及刪除有效性等障礙.

在控制刪除階段,位點特異重組系統(tǒng)利用可控制的自我刪除途徑,克服了二次轉化和有性雜交等刪除方式轉化效率不高,操作周期長等弊端,同樣適用于無性繁殖的植物,一步即可獲得目的植株,大大簡化了操作步驟,實現(xiàn)對基因靶位點時空上的精確調控,從而獲得無標記基因的轉基因個體,在煙草、擬南芥等雙子葉模式植物中得到了廣泛的應用.在轉基因植物的T0代通過控制誘導重組酶基因的表達就可以實現(xiàn)標記基因的有效刪除,縮短了標記基因和重組酶基因的刪除時間,避免了由于重組酶的過量表達對植物的傷害.采用可控的誘導型啟動子雖然克服了簡單刪除階段二次轉化和有性雜交的不足,但早期的研究中由于啟動子驅動能力不足,另外FLP重組酶表達量較小,造成刪除效率普遍較低.較低的刪除效率,尤其是單子葉植物中的較低的刪除效率,在很大程度上限制了可控刪除系統(tǒng)在獲得無選擇標記轉基因植物中的生產應用.

2.3 高效刪除

高效刪除實際上是對控制刪除的進一步改良和發(fā)展.高效刪除階段一方面通過采用啟動能力強的強啟動子如組織特異性啟動子,另一方面通過在載體中插入促進重組酶和特異性位點識別或結合的序列來改進載體構建策略,從而提高重組酶的表達量以及與特異識別位點的結合能力,從而提高刪除效率.近年來,Luo等[21-23]在利用改良型的雜合loxP-FRT識別位點進行標記基因的高效刪除與基因整合方面,進行了大量研究.2005年,Luo等[21]采用來自于擬南芥的熱激蛋白Hsp18.2基因啟動子控制重組酶基因FLP的表達,同時以GUS基因作為報告基因,抗生素抗性基因（NPTⅡ）作為篩選標記基因,構建了一個新的重組酶刪除系統(tǒng).該系統(tǒng)采用loxP-FRT融合識別位點代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單識別位點,將所有外源基因置于重組酶系統(tǒng)的兩個識別點之間,當獲得轉基因植株后,采用熱激處理的方式啟動重組酶基因的表達,迅速刪除轉基因植物中所有外源基因,獲得了高達84.9%的刪除效率.2007年,羅克明等[22]在其構建的改良型的雜合loxP-FRT識別位點間加入8 bp的間隔序列融合構成一個新的雜合識別位點loxP-FRT,即GM-gene-deletor,對煙草的轉化試驗結果表明,以來自擬南芥的種子組織特異性啟動子PAB5驅動的重組酶Cre和FLP基因同時表達時其刪除效率在一個較低水平；當Cre或FLP基因單獨表達時可顯著提高位點特異性重組酶系統(tǒng)在轉基因植物中對外源基因的刪除效率,刪除效率可達100%,并且在轉基因自交或雜交后代種子中的外源基因刪除率達到了100%,同時證明了這種刪除系統(tǒng)能在無性生殖后代中得到穩(wěn)定的遺傳.值得注意的是在GM-gene-deletor系統(tǒng)中,當Cre和PLP重組酶同時表達時,其刪除效率非常低.但是,當重組酶Cre或FLP單獨表達時,其對外源基因的刪除效率達到了100%.Luo等[23]在煙草中利用來自擬南芥的熱誘導型啟動子Hsp18.2控制FLP重組酶表達,刪除了位于2個loxP-FRT位點之間的異選擇標記基因（ipt）、報告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）以及FLP重組酶編碼基因,獲得無選擇標記的轉基因煙草.所構建的GM-gene-deletor系統(tǒng)大大提高了包括選擇標記基因以及改良植物抗性和品質的目的基因在內的所有外源基因的刪除效率（試驗證明其刪除效率可達到100%）,減輕了公眾對于轉基因作物或者食品的一系列擔憂.人們不必擔心轉基因作物中的標記基因通過種子或花粉以“基因漂流”等方式流入自然界中,也不用擔心轉基因作物中攜帶的外源基因和蛋白對人體產生的副作用,有力地推動了轉基因產品的商業(yè)化進程.雖然,GM-gene-deletor可以將所有的外源功能基因進行刪除,但是FLP酶切口處仍保留了一段86 bp的無蛋白質編碼功能的loxP-FRT序列,這樣就仍然含有冗余的外源DNA序列.所幸的是,時至今日尚無有力證據表明這種“殘留”對于環(huán)境和人體健康具有威脅.

3 小結

研發(fā)和應用轉基因植物安全技術體系,是轉基因植物研究健康發(fā)展的重要保障,也是推動轉基因作物商業(yè)化和產業(yè)化的重要突破口.FLP/FRT位點特異性重組系統(tǒng)為無標記轉基因植物的獲得提供了一個重要的手段.在應用中,可以通過二次轉化或與含重組酶基因的轉基因植株雜交來組成性表達重組酶,或利用瞬時表達、誘導性表達、組織特異性表達重組酶來剔除選擇標記基因.FLP/FRT位點特異重組系統(tǒng)的不斷改善和發(fā)展一方面為農作物復雜性狀的改良提供了可能,實現(xiàn)了轉基因植物的持續(xù)改良.另一方面,會一定程度上消除轉基因植物對人類健康和環(huán)境安全等方面造成的隱患,加速轉基因作物的商業(yè)化和產業(yè)化.另外,FLP/FRT位點特異重組系統(tǒng)發(fā)展在改進植物表達載體、創(chuàng)建優(yōu)良的育種材料以及利用可控制的基因刪除技術研究基因的功能以及細胞信號傳導途徑的研究等方面也日益凸顯其無可比擬的優(yōu)越性.盡管目前FLP/FRT位點特異重組系統(tǒng)研究和應用仍存在諸多不足,如融合2個位點的雜合系統(tǒng)反應機制還缺乏充足的理論依據；FLP/FRT系統(tǒng)往往會因為該系統(tǒng)在某些種類的生物中較低的重組效率而受到影響.但隨著科研人員研究的不斷深入,FLP/FRT系統(tǒng)在后基因組時代基因功能的研究,特別是實現(xiàn)對靶基因的定點刪除與調控、生產具有商業(yè)價值的轉基因植物等生物技術應用領域的研究方面,必將發(fā)揮重要的作用.

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