王樹(shù)杉, 于 敏, 張曉華

(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

海洋細(xì)菌素的研究進(jìn)展

Research and prospect of bacteriocins from marine bacteria

王樹(shù)杉, 于 敏, 張曉華

(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

在自然環(huán)境中, 有些微生物通過(guò)抑制或殺死另一種微生物的拮抗作用來(lái)獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。有的細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素, 可殺死與其親緣關(guān)系相近種。細(xì)菌素通常是指由細(xì)菌分泌的、對(duì)同種或其他親緣關(guān)系很近的細(xì)菌有抑制作用的一種蛋白類抑菌物質(zhì)。細(xì)菌素的蛋白質(zhì)性質(zhì)以及多種明顯區(qū)別于抗生素的優(yōu)點(diǎn),使其具有廣闊的應(yīng)用空間。據(jù)報(bào)道, 海洋細(xì)菌中的多個(gè)屬種都具有抑制其他海洋細(xì)菌或各種動(dòng)植物病原菌生長(zhǎng)的活性。海洋細(xì)菌作為發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素的潛在重要來(lái)源, 受到了越來(lái)越多的關(guān)注, 各國(guó)研究者已經(jīng)成功地從海洋細(xì)菌中分離得到細(xì)菌素及類細(xì)菌素。本文將對(duì)具有抑菌活性的海洋細(xì)菌研究概況, 海洋細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的研究進(jìn)展, 以及其應(yīng)用前景加以論述。

1 具有抑菌作用的海洋細(xì)菌

1.1 海洋細(xì)菌抑菌活性研究概況

早在1927年, 德國(guó)科學(xué)家Ko?inek[1]就發(fā)現(xiàn)海水可以抑制大多數(shù)非海洋細(xì)菌的生長(zhǎng)。20世紀(jì)30年代,Zobell[2]、Carpenter 等[3]、Beard 和 Meyers[4]也相繼報(bào)道了海水對(duì)于多種革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌的抑制作用?？茖W(xué)家們推測(cè),海水的這種抑菌特性主要是來(lái)自于海洋微生物產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。此后, 越來(lái)越多的具有抑菌活性的海洋細(xì)菌被分離出來(lái)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究表明,來(lái)源于不同海域、海洋動(dòng)植物體表或體內(nèi)以及海洋沉積物的海洋細(xì)菌,多個(gè)屬種都具有抑菌活性,占有相當(dāng)比例。日本近年來(lái)對(duì)海洋微生物進(jìn)行了廣泛研究,發(fā)現(xiàn)約有 27%的海洋微生物具有抑菌活性[5]。在蘇格蘭沿岸海水中的海藻及無(wú)脊椎動(dòng)物樣品中分離到 400株生物體表附著細(xì)菌, 其中35%的菌株有拮抗活性[6]。Anand等[7]于 2006年從印度洋東南海區(qū)海綿中分離出 75株海洋細(xì)菌,其中21%的菌株有抑菌活性, 可以抑制多種細(xì)菌或真菌性病原菌。在南極海域采集到的580株海洋細(xì)菌中,22株對(duì)大腸桿菌等陸生菌具有抑菌作用, 其中同一屬種海洋細(xì)菌的表型和抑菌作用方式也不同, 具有很強(qiáng)的個(gè)體差異[8]。2008年, Wiese等[9]對(duì)從波羅地海褐藻Laminaria saccharina中分離出的具有抑菌活性的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究, 在采集到的 210株海洋細(xì)菌中有 103株有抑菌活性,分屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的21個(gè)屬。

1.2 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的有抑菌活性的海洋細(xì)菌種類

目前已報(bào)道,海洋細(xì)菌中多個(gè)屬種都具有抑菌活性,主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、海洋單胞菌屬(Marinomonas)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus) 、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium) 、玫瑰桿菌屬(Roseobacter)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、歐文氏菌屬(Erwinia)等。

1.2.1 假單胞菌屬

假單胞菌是專性需氧的革蘭氏染色陰性無(wú)芽胞桿菌, 具端生鞭毛, 能運(yùn)動(dòng)。有些菌株產(chǎn)生熒光色素或(和)紅、藍(lán)、黃、綠等水溶性色素, 不發(fā)酵糖類。據(jù)報(bào)道, 熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)F19/13能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的游離鐵離子, 競(jìng)爭(zhēng)排斥殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida), 減少養(yǎng)殖鮭魚(yú)病害發(fā)生的機(jī)率[10]。將熒光假單胞菌應(yīng)用到虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖中, 對(duì)虹鱒魚(yú)的病原菌——鰻弧菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑菌作用, 可以有效降低虹鱒魚(yú)的死亡率[11]。

1.2.2 氣單胞菌屬

氣單胞菌屬于弧菌科, 是常見(jiàn)的腐物寄生菌,廣泛分布于土壤、海水、動(dòng)物腸道中。從中國(guó)大連海域海泥樣品中分離得到一株具有很強(qiáng)抑菌活性的海洋細(xì)菌,可以抑制大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、普通變形菌(Proteus vulgaris)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的生長(zhǎng), 經(jīng)鑒定屬于氣單胞菌屬[12]。嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)是這一屬的代表種, Patrizia等[13]發(fā)現(xiàn)分離自水體的嗜水氣單胞菌能夠產(chǎn)生類細(xì)菌素的抑菌物質(zhì),拮抗葡萄球菌(Staphylococcus)、李斯特菌(Listeria)等革蘭氏陽(yáng)性菌。

1.2.3 交替單胞菌屬

交替單胞菌為革蘭氏陰性菌, 曲桿狀, 具單側(cè)極生鞭毛, 通常分布于海洋或者沿岸地區(qū)。扇貝性腺中分離到的河豚毒素交替單胞菌(Alteromonas haloplanktis), 能夠產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì), 被成功用于扇貝幼體養(yǎng)殖中, 可拮抗養(yǎng)殖水體中的病原弧菌,保障扇貝幼體的正常生長(zhǎng)[14]。

1.2.4 假交替單胞菌屬

假交替單胞菌屬是 Gaulthier等[15]于 1995年報(bào)道的新屬, 屬變形菌門, γ-變形菌綱, 交替單胞菌目,假交替單胞菌科, 革蘭氏染色陰性。目前該屬有 30余種細(xì)菌, 全部來(lái)自于海洋。該屬細(xì)菌的代謝類型眾多, 種間形態(tài)和生理生化特征差異較大, 有些種類可產(chǎn)生色素, 有些種類則可以分泌抗細(xì)菌、抗真菌、殺藻類、溶瓊脂、細(xì)胞毒和抗病毒等生物活性物質(zhì)。Kjelleberg實(shí)驗(yàn)室[16-18]近十幾年來(lái), 對(duì)被囊假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tunicata)和石莼假交替單胞菌(P. ulvae)的抑菌活性及抑菌物質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、作用方式、產(chǎn)生條件等各方面進(jìn)行了深入研究。

1.2.5 海洋單胞菌屬

海洋單胞菌屬最早是在 1983年由 Van Landschoot和 DeLey為了給兩株特別的交替單胞菌屬的菌種歸類提出的[19]。目前已報(bào)道該屬的地中海海洋單胞菌(Marinomonas mediterranea)可以分泌產(chǎn)生一種廣譜抑菌蛋白 Marinocine, 對(duì)多株革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌株均有抑菌作用[20]。

1.2.6 弧菌屬

弧菌屬為革蘭氏陰性菌, 屬兼性厭氧菌, 多生活于水中。弧菌屬中的許多種類都屬于養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌, 例如鰻弧菌(V. anguillarum)、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)及牙鲆腸弧菌(V.ichthyoenteri)等。但同時(shí), 弧菌屬的某些種類也可以其分泌的抑菌活性物質(zhì)來(lái)拮抗其他病原菌的生長(zhǎng)。Sugita等[21]從日本海域的魚(yú)腸道中分離出一株弧菌 NM10, 該弧菌對(duì)于魚(yú)類病原菌巴斯德氏菌(Pasteurella)具有較強(qiáng)的抑制作用。從中國(guó)海南周邊海域分離篩選出的一株具有抑菌活性的海洋細(xì)菌B2817, 經(jīng)鑒定屬于弧菌屬的一個(gè)新種[22]。

1.2.7 芽孢桿菌屬

芽孢桿菌屬為革蘭氏陽(yáng)性菌, 已報(bào)道的該屬細(xì)菌中有多種屬于海洋細(xì)菌。田黎等[23]從東海大陸架、渤海、珠江口、黃島等地采集菌株, 篩選出若干株具有抑菌活性的芽孢桿菌, 其抑菌譜廣, 性狀穩(wěn)定。還有報(bào)道海泥中也分離出了有抑菌效果的芽孢桿菌,該菌的代謝產(chǎn)物對(duì)多種細(xì)菌有抑菌作用[24]。

1.2.8 發(fā)光桿菌屬

屬于革蘭氏陰性菌, 具極生鞭毛,分離自海洋環(huán)境和海生動(dòng)物的消化道中。從健康養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦腸道內(nèi)分離出的發(fā)光桿菌對(duì)哈維氏弧菌、費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和熒光假單胞菌都有拮抗作用[25]。

1.2.9 玫瑰桿菌屬

玫瑰桿菌屬于革蘭氏陰性菌。Planas等[26]發(fā)現(xiàn)一株玫瑰桿菌屬細(xì)菌對(duì)鰻弧菌具有良好的抑制作用,將其應(yīng)用到注射鰻弧菌的大菱鲆(Scophthatmus maximus)幼魚(yú)中, 發(fā)現(xiàn)該菌能較強(qiáng)地抑制鰻弧菌的生長(zhǎng),保護(hù)幼魚(yú)。

1.2.10 肉桿菌屬

肉桿菌屬為革蘭氏陽(yáng)性菌, 出現(xiàn)于肉產(chǎn)品和魚(yú)中。從新鮮魚(yú)樣品中或者冷凍魚(yú)肉中分離得到的棲魚(yú)肉桿菌(Carnobacterium piscicola)具有抑菌作用,能夠抑制冷藏熏三文魚(yú)肉中的單核球增多性李斯特菌(L. monocytogenes)的生長(zhǎng)[27]。

1.2.11 歐文氏菌屬

歐文氏菌常寄生于植物并引起腐敗病, 是酷似大腸桿菌的一種細(xì)菌。屬名是為了尊重美國(guó)植物病理學(xué)家 Erwin F．Smith而得名, 但不少學(xué)者認(rèn)為應(yīng)納入大腸桿菌類, 屬于桿菌屬。據(jù)報(bào)道, 分離自海洋環(huán)境的歐文氏菌(Erwiniasp.)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)具有強(qiáng)抑制作用[28]。

2 海洋細(xì)菌素的研究進(jìn)展

2.1 細(xì)菌素的概述

細(xì)菌素是一類由核糖體合成的、在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的具有蛋白質(zhì)特性、對(duì)其他細(xì)菌(尤其是親緣關(guān)系較近的細(xì)菌)有拮抗作用的殺菌物質(zhì)[29-30]。最早由Gratia[31]于1946年對(duì)大腸桿菌的研究中提出, 后來(lái)發(fā)現(xiàn)很多細(xì)菌都可以產(chǎn)生類似物質(zhì), Jacob[32]于1953年將這類物質(zhì)稱為細(xì)菌素。細(xì)菌素既有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)或陽(yáng)離子多肽,又有高分子質(zhì)量的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

2.1.1 細(xì)菌素的分類

由革蘭氏陽(yáng)性菌乳酸菌分泌的細(xì)菌素可分為 3型[33-34],其中Ⅰ型細(xì)菌素,又稱羊毛硫抗生素(Lantibiotics), 其分子質(zhì)量＜5 kDa, 顯著特點(diǎn)是翻譯后經(jīng)過(guò)修飾, 分子活性部位含有大量的稀有氨基酸,如羊毛硫氨(Lanthionine)、β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)等。這類多肽還可以分成兩小類：一類結(jié)構(gòu)柔軟, 帶正電和疏水基團(tuán), 可在靶細(xì)胞膜上形成通道而起作用; 另一類是球狀多肽, 不帶電或帶負(fù)電荷。Ⅱ型細(xì)菌素為小分子的熱穩(wěn)定肽(SHSP), 分子質(zhì)量＜10 kDa,翻譯后不被修飾(二硫鍵除外), 屬陽(yáng)離子多肽, 分為三個(gè)亞類：⑴ N -末端氨基酸序列為：Tyr-Gly-Asn-Gly-Val 并由兩個(gè)半胱氨酸所構(gòu)成的 S-S 橋, 具有抗李斯特菌活性; ⑵ 孔道復(fù)合物由兩個(gè)具不同氨基酸序列的肽類寡聚體形成; ⑶ 能被硫醇激活、活性基團(tuán)有還原性半胱氨酸殘基。Ⅲ型細(xì)菌素為大分子熱不穩(wěn)定肽(LHLP), 分子質(zhì)量＞10 kDa, 具熱不穩(wěn)定性。

由革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的細(xì)菌素可分為大腸桿菌素(colicin)和小菌素(microcin)[33-34]。大腸桿菌素的分子質(zhì)量為25～28 kDa。小菌素通常是由細(xì)菌細(xì)胞分泌產(chǎn)生的, 分子質(zhì)量＜10 kDa, 熱穩(wěn)定性好, 對(duì)鏈霉蛋白酶和枯草溶菌素有抗性; 所有的小菌素都需特定的細(xì)胞表面受體才能進(jìn)入細(xì)胞, 其中小菌素又可進(jìn)一步分成兩種類型, 一類為分子質(zhì)量＜5 kDa, 翻譯后被修飾, 且作用位點(diǎn)在細(xì)菌胞內(nèi); 另一類小菌素的分子質(zhì)量為7～10kDa, 翻譯后不被修飾, 屬陰離子多肽,作用位點(diǎn)在細(xì)菌膜上。

目前, 國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌素的研究較深入,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種細(xì)菌素, 被鑒定的細(xì)菌素有 Nisin、Laetacin、Laeloein、Helvetiein、Fermentiein、Sakeein、Laetiein、Plantaein、Subtiein等, 其中已被廣泛應(yīng)用的是Nisin, 也稱尼生素。

2.1.2 細(xì)菌素的作用機(jī)制

細(xì)菌素的抑菌譜往往比真核生物產(chǎn)生的抗菌肽(antimicrobial peptides)的抑菌譜窄,但其作用濃度卻比真核生物分泌的抗菌肽要低很多,這可能與靶細(xì)胞上有細(xì)菌素的特異性受體有關(guān)[34]。

細(xì)菌素的作用機(jī)制主要是通過(guò)吸附于敏感細(xì)菌,與其細(xì)胞膜上的特異性細(xì)胞膜外蛋白受體結(jié)合, 借助于兩條不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)來(lái)達(dá)到殺死該菌細(xì)胞的目的：(1) 形成孔道, 結(jié)合在作用細(xì)菌的細(xì)胞膜上, 與細(xì)胞膜上特異受體結(jié)合, 形成1個(gè)孔道, 改變細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度, 從而導(dǎo)致作用細(xì)胞的死亡。(2) 核酸內(nèi)切酶作用, 通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)的染色體, 抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成以殺死細(xì)菌。(3) 其他作用方式,例如大腸桿菌素M可以抑制細(xì)胞壁脂多糖O-抗原生物合成; 在羊毛硫細(xì)菌素中, 一些細(xì)菌素通過(guò)與細(xì)胞壁上一些蛋白的結(jié)合而阻止細(xì)胞壁的形成進(jìn)行殺菌。

2.1.3 細(xì)菌素與抗生素的區(qū)別

細(xì)菌素與抗生素都能較強(qiáng)地抑制甚至殺死其他微生物, 具有一定的抑菌譜。因?yàn)榧?xì)菌素具有與抗生素相似的一些性質(zhì)和作用, 因此細(xì)菌素最初甚至被認(rèn)為就是抗生素。但細(xì)菌素和抗生素是不同的, 抗生素是某些微生物通過(guò)酶促反應(yīng)將初級(jí)代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)性的次級(jí)代謝物, 不存在結(jié)構(gòu)基因。而細(xì)菌素一般是通過(guò)核糖體直接合成的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。編碼細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)編碼基因, 以及賦予宿主對(duì)該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上。因此, 細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。

與抗生素相比, 細(xì)菌素具有很多的優(yōu)點(diǎn)：大部分細(xì)菌素只對(duì)近緣關(guān)系的細(xì)菌有損害作用, 且無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性, 同時(shí)也不污染環(huán)境。

2.2 海洋細(xì)菌素的研究進(jìn)展

2.2.1 海洋細(xì)菌素的研究概況

由于海洋具有高壓、高鹽、低營(yíng)養(yǎng)、低溫、無(wú)光照以及局部高溫等獨(dú)特的環(huán)境, 造就了海洋細(xì)菌種類的特異性及代謝途徑的多樣性, 可產(chǎn)生與陸地細(xì)菌不同的生物活性物質(zhì)。

關(guān)于海洋細(xì)菌分泌抑菌物質(zhì)的研究報(bào)道已有很長(zhǎng)一段時(shí)間[35-36], 但早期報(bào)道的多為分離自海洋微生物的低分子質(zhì)量抑菌物質(zhì)。細(xì)菌素的研究多集中于乳酸桿菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等來(lái)自于陸生生物或陸地環(huán)境的菌種, 關(guān)于海洋細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的報(bào)道較少。最近十幾年, 隨著研究的深入, 海洋細(xì)菌作為發(fā)現(xiàn)抑菌肽和抑菌蛋白的潛在重要來(lái)源, 受到了越來(lái)越多的關(guān)注, 各國(guó)研究者成功地從多種海洋細(xì)菌中分離得到細(xì)菌素或類細(xì)菌素, 并應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)等手段, 進(jìn)一步加深對(duì)海洋細(xì)菌抑菌蛋白類物質(zhì)的研究與應(yīng)用。

國(guó)外對(duì)于海洋細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的研究開(kāi)展較早。早在1989年, Barja等[35]就從分離自西班牙東北海岸海水樣品的一株交替單胞菌株P(guān)-31中分離純化得到一種抑菌蛋白。隨后, Austin等[36]也從海水以及魚(yú)、蟹、貝類等海水養(yǎng)殖生物體內(nèi)分離到一株動(dòng)性球菌屬(Planococcus)的菌株, 能夠產(chǎn)生細(xì)菌素抑制魚(yú)類病原菌。1997年, Sugita等[21]在魚(yú)體腸道篩選出抑制巴斯德菌的弧菌 NM10, 分離得到小于 5kD的類細(xì)菌素。Kjelleberg實(shí)驗(yàn)室最近十幾年關(guān)于被囊假交替單胞菌生物活性的研究證實(shí), 被囊假交替單胞菌能夠分泌一種大小約 190 kDa的專性抑制細(xì)菌的大分子蛋白質(zhì)(命名為 AlpP)[16], 屬于一種新型的細(xì)菌素。

國(guó)內(nèi)關(guān)于海洋細(xì)菌分泌產(chǎn)生細(xì)菌素的研究起步較晚。2001年, 莫照蘭等[37]發(fā)現(xiàn)氣味黃桿菌(Flavobacteria ordoratum) QJ2對(duì)對(duì)蝦病原菌哈維氏弧菌有良好的抑制作用。經(jīng)生理生化測(cè)定, 確定該抑菌產(chǎn)物為具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的細(xì)菌素。李會(huì)榮等[38]也于2001年從健康的斑節(jié)對(duì)蝦幼體及其養(yǎng)殖環(huán)境中分離的213株菌中, 篩選出5株對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)蝦主要病原菌有明顯抑菌效果的細(xì)菌, 其中一株鑒定為橙色假交替單胞菌(P. aurantia), 該菌能產(chǎn)生一種蛋白性質(zhì)的抑菌物質(zhì), 但其分子質(zhì)量大小尚不清楚。

2.2.2 目前主要研究的海洋細(xì)菌素及其性質(zhì)

Carnocin UI49是由棲魚(yú)肉桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素。棲魚(yú)肉桿菌最初分離自新鮮的魚(yú)樣品中。該細(xì)菌素分泌于細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期, 可以抑制多種近緣細(xì)菌的生長(zhǎng), 且具有裂解感覺(jué)細(xì)胞的特殊抑菌作用模式。隨后, Yamazaki等[39]又從另一株棲魚(yú)肉桿菌 CS526中純化出細(xì)菌素 Piscicocin CS256。Piscicocin屬于IIa型細(xì)菌素, 大小為 4430Da, 可以抑制腸球菌(Enterococcussp.)、李斯特菌、小球菌(Pediococcussp.)的生長(zhǎng)。Piscicocin CS256作用的pH范圍較廣, 對(duì)熱穩(wěn)定, N端序列為YGNGL。

養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌——?jiǎng)?chuàng)傷弧菌同樣也可以產(chǎn)生抑制親緣關(guān)系較近的其他病原弧菌的細(xì)菌素。Shehane等[40]從采集自美國(guó)沿海水樣中的具有抑菌活性的創(chuàng)傷弧菌中純化出兩種細(xì)菌素BC1和BC2。其中 BC1能夠抑制創(chuàng)傷弧菌本身、霍亂弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌。BC2具有較廣的抑菌譜, 可以抑制所有被測(cè)弧菌, 以及類志賀毗鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides) 和大腸桿菌。BC2性質(zhì)十分穩(wěn)定, 經(jīng)冷凍、高溫高壓處理或者是強(qiáng)酸堿處理后仍具有活性。細(xì)菌素BC2的廣譜抑菌性以及穩(wěn)定性為殺死魚(yú)類病原弧菌提供了新的藥物來(lái)源。

同樣是很多魚(yú)類致病菌的哈維氏弧菌 VIB571,也會(huì)產(chǎn)生類細(xì)菌素[41]。該類細(xì)菌素可以抑制其他 4株弧菌, 但VIB571自身卻沒(méi)有受到抑制影響。它的活性會(huì)受到脂酶、蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰島素、鏈霉蛋白酶E、SDS的抑制; 60℃下處理10 min后活性喪失; 而pH2-11范圍內(nèi)該類細(xì)菌素活性至少可維持 5 h。為了研究編碼該類細(xì)菌素基因所處的位置,使用了半致死劑量的DNA破壞劑, 觀察菌體類細(xì)菌素產(chǎn)物的應(yīng)急變化情況。與多數(shù)細(xì)菌在DNA被破壞時(shí)分泌細(xì)菌素增多不同, VIB571分泌的類細(xì)菌素并沒(méi)有出現(xiàn)應(yīng)急性的增高。VIB571也沒(méi)有被提取出任何質(zhì)粒, 這表明該類細(xì)菌素很可能是由染色體編碼,而并不是多數(shù)細(xì)菌素的質(zhì)粒編碼。

來(lái)自于海藻表面的地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)產(chǎn)生一種分子質(zhì)量為 30.7 kDa的新型細(xì)菌素[42]。抑制甲氧苯青霉素耐受性金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素的腸球菌和李斯特菌。該細(xì)菌素與已經(jīng)報(bào)道的另一株芽孢桿菌的抑菌蛋白 YbdN有很高的相似性。由于抗生素的廣泛使用, 越來(lái)越多的人類和動(dòng)物的致病菌產(chǎn)生了耐藥性, 因此, 尋找對(duì)耐藥性病原菌有抑制作用的細(xì)菌素物質(zhì)非常必要。對(duì)于該海洋地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的新型細(xì)菌素的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究, 為將來(lái)實(shí)驗(yàn)室制出, 甚至是大型生產(chǎn)對(duì)抗耐藥性致病菌的藥物, 奠定了基礎(chǔ)。

Marinocine是分離自地中海海洋單胞菌的一種大分子廣譜抑菌蛋白[20]。由 Lucus-Elio等分離純化了 Marinocine, 并且用簡(jiǎn)并引物克隆了編碼該細(xì)菌素的基因 lodA。該細(xì)菌素具有相對(duì)熱穩(wěn)定性, 對(duì)許多水解酶(如糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶)有抵抗力, 分子質(zhì)量在140～170kDa范圍。其抑菌譜很廣, 可以抑制包括一些 G+和 G—細(xì)菌、醫(yī)院分離的臨床致病菌株以及對(duì)傳統(tǒng)抗生素高度耐藥的葡萄球菌和假單胞菌, 但對(duì)檢測(cè)的真核生物無(wú)任何作用。細(xì)菌素Marinocine只有在含有 L－賴氨酸的培養(yǎng)基并且是在好氧條件下才具有抑菌效應(yīng)。最近, Marinocine被證實(shí)是一種新的賴氨酸氧化酶[43], 能催化 L－賴氨酸的氧化脫氫反應(yīng), 形成6－半醛－2－氨基己二酸、氨氣和過(guò)氧化氫。正是因?yàn)?Marinocine可以催化賴氨酸產(chǎn)生過(guò)氧化氫這一區(qū)別于其他賴氨酸酶的特性,才使得其具有特殊的抑菌活性。關(guān)于 Marinocine抑菌作用機(jī)理的研究為其他海洋細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用提供了非常好的資料。

2.3 海洋細(xì)菌素的應(yīng)用前景

細(xì)菌素本身具有許多優(yōu)良性質(zhì)：具有較好的選擇性殺菌效果; 不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積而引起不良反應(yīng), 無(wú)副作用、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性, 易被人體消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶)所降解; 具有熱穩(wěn)定性, 并耐酸、耐低溫貯藏; 同時(shí)也不會(huì)造成環(huán)境污染。為了檢驗(yàn)細(xì)菌素的安全性和有效性, Bhunia等[44]用細(xì)菌素pediocin AcH對(duì)小鼠和兔子分別進(jìn)行皮下注射、靜脈注射和腹腔注射進(jìn)行免疫研究時(shí)發(fā)現(xiàn),pediocin AcH沒(méi)有致死作用, 也沒(méi)有導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)對(duì)象產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。目前細(xì)菌素已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料、醫(yī)療、生物防治等領(lǐng)域。其中以食品工業(yè)的應(yīng)用最為廣泛, 乳酸菌的細(xì)菌素產(chǎn)物Nisin在乳制品、肉制品、罐頭制品中的使用已有很長(zhǎng)一段時(shí)間。

與陸生菌細(xì)菌素的廣泛應(yīng)用相比, 處于研究起步階段的海洋細(xì)菌素的安全性及有效性還沒(méi)有得到檢驗(yàn), 應(yīng)用范圍也沒(méi)有確定。但越來(lái)越多的學(xué)者將目光放在了水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用海洋細(xì)菌素來(lái)防治水產(chǎn)動(dòng)物病害的發(fā)生。當(dāng)前, 水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的濫用已導(dǎo)致了養(yǎng)殖水體的污染, 并且使許多致病菌產(chǎn)生了耐藥性, 對(duì)于新型抑菌活性物質(zhì)的需求越來(lái)越迫切。海洋細(xì)菌分泌的細(xì)菌素由于其安全性和有針對(duì)性的抑菌效果, 受到了越來(lái)越多的關(guān)注。Longeon等[45]使用分泌抑菌蛋白的抑菌交替單胞菌 X153 對(duì)雙殼類幼體進(jìn)行毒性測(cè)試, 結(jié)果顯示, 經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng), 該菌株對(duì)雙殼類幼體沒(méi)有明顯的毒性作用,并且能夠有效降低其死亡率,這為防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生提供新的思路。由于海洋細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜, 除了可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌的防治之外, 還可以向治療人類的疾病(例如皮膚病)的領(lǐng)域拓展。

此外, 海洋細(xì)菌素還可以作為防止生物污損(biofouling)的一項(xiàng)重要手段。海洋微生物在物體表面的不良沉積會(huì)導(dǎo)致污損現(xiàn)象的發(fā)生, 這嚴(yán)重影響著船舶的性能和壽命, 使船舶航速降低、靈活性減弱、燃料的消耗增加、殼體的腐蝕加速等。海洋細(xì)菌素可以有效抑制污損微生物的生長(zhǎng), 從而達(dá)到防止生物污損的目的。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述, 海洋細(xì)菌抑菌活性的研究已經(jīng)日趨成熟, 可開(kāi)發(fā)利用的菌株也不斷增加。但是仍有許多方面的研究做的不夠深入, 仍沒(méi)有足夠的證據(jù)充分證明可以成功應(yīng)用海洋細(xì)菌來(lái)抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌的理論。一些研究成果認(rèn)為通常體外試驗(yàn)結(jié)果在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)也是有效的, 但實(shí)際上仍然需要考慮到細(xì)菌之間的競(jìng)爭(zhēng)作用。許多拮抗菌的試驗(yàn)結(jié)果,僅局限于單一菌株使用。然而, 如果多種細(xì)菌制成的混合制劑可以適應(yīng)不同條件的需求, 那么多種細(xì)菌協(xié)調(diào)作用的效果很可能比單一細(xì)菌的效果更明顯。

海洋細(xì)菌分泌的細(xì)菌素對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的多種致病菌有良好的抑制作用, 國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注這一領(lǐng)域并取得了一定的研究成果。然而, 目前對(duì)于海洋細(xì)菌素的研究多集中于對(duì)其的分離純化、生物學(xué)性質(zhì)的研究, 以及分子質(zhì)量和 N端氨基酸序列的測(cè)定。對(duì)于后續(xù)的研究, 還存在一定的難題有待解決。許多細(xì)菌素的作用機(jī)理尚不明確, 需要通過(guò)拮抗菌與病原菌的混合培養(yǎng), 對(duì)病原菌細(xì)胞形態(tài)變化情況的觀察加以研究; 由于細(xì)菌素的不穩(wěn)定性以及獲得足夠抑菌效果濃度的困難性, 很多情況下無(wú)法直接進(jìn)行細(xì)菌素對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的毒性測(cè)試; 另外, 細(xì)菌素的大量獲得要借助基因工程手段,可以根據(jù)其氨基酸序列同源性, 設(shè)計(jì)出適合的 PCR引物, 擴(kuò)增編碼細(xì)菌素的基因片斷, 再將此編碼基因克隆至大腸桿菌的表達(dá)載體, 表達(dá)并純化得到大量重組的細(xì)菌素,用于進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。

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Q93.335 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)01-0125-07

2011-01-09;

2011-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40876067); 國(guó)家 863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA09Z434)

王樹(shù)杉(1984-), 女, 碩士, 研究方向：海洋微生物學(xué),E-mail：shanshan840309@yahoo.com; 張曉華, 通信作者, 女, 博士,教授, 從事海洋微生物學(xué)研究, 電話：0532-82032767, Email：xhzhang@ouc.edu.cn

張培新)