張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

海帶中巖藻多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋*

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

通過DEAE-纖維素和凝膠過濾色譜反復(fù)柱層析，采用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)檢測(cè)，從提取的海帶巖藻多糖中得到了均一多糖TC-1，并結(jié)合多種分析手段：包括糖組成分析、甲基化分析、紅外光譜(IR)分析等對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：TC-1重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)為3.7×105，主要由巖藻糖構(gòu)成，此外還伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

海帶；巖藻多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)分析

海帶具有很高的食用、藥用價(jià)值。研究表明，海帶所含的巖藻多糖具有明顯的生理活性，如抗腫瘤、促進(jìn)造血功能等[1-2]。隨著人們對(duì)巖藻多糖的深入研究，得知其并非單一結(jié)構(gòu)的化合物，其組成十分復(fù)雜，稱為含巖藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides)。由于巖藻多糖的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素影響[3]，目前國內(nèi)外的報(bào)道對(duì)其結(jié)構(gòu)組成沒有統(tǒng)一的定義，大多是對(duì)其進(jìn)行初步純化[4]，得到巖藻多糖的混合物。國外部分學(xué)者對(duì)巖藻多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[4-6]，但海帶的深度開發(fā)卻涉及較少。本研究利用我國資源豐富的海帶，綜合各種分離手段，得到均一多糖組分，并鑒定了它的一級(jí)結(jié)構(gòu)，旨在為今后巖藻多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)資料和結(jié)構(gòu)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶產(chǎn)自山東威海。

DEAE-纖維素 美國Whatman公司；Sephacryl S-300、S-200凝膠層析介質(zhì) 美國Pharmacia公司；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 美國Fluka公司；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量1000) 上海綠鳥科技公司；纖維素板 上海市藥品檢驗(yàn)所；單糖對(duì)照品 美國Sigma公司；無水二甲亞砜、無水硫酸鈉、碘甲烷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷 上海化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TL-5.0臺(tái)式離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；BT-100恒流泵 上海市滬西分析儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器 上海市青浦滬西儀器廠；玻璃層析柱 上海市亞榮生化儀器廠；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所；FD1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司；vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國Sartorius Gmbh公司；Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent 6890 5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(色譜柱為HP-5型毛細(xì)管柱) 美國安捷倫有限公司；Nicolet Magna-IR550紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 海帶中巖藻多糖的提取[7-8]

取潔凈干燥的海帶50g，粉碎后用無水乙醇浸泡，脫脂后的固體殘?jiān)盟崛?料液比1:10(m/V)，60℃提取2h)，提取3次，合并提取液，離心，濃縮上清液至小體積，加入無水乙醇，至所含乙醇的體積分?jǐn)?shù)為3 0%，過濾，上清液再加無水乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為60%，離心收集沉淀，真空干燥得巖藻多糖粗品。

將巖藻多糖配成5g/100mL的水溶液，用CaCl2對(duì)其進(jìn)行初步純化。溶液中加入4mol/L CaCl2，離心后取上清液，加乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為65%，用乙醇和丙酮浸洗沉淀，40℃干燥得到巖藻多糖。

1.4 巖藻多糖的分離純化[9]

稱取2g巖藻多糖溶于20mL去離子水，經(jīng)DEAE-纖維素柱(1.5cm×50cm)初步分離。依次用去離子水和0.6、1.0、2.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫流速為2mL/min，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。將各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當(dāng)體積，對(duì)蒸餾水透析，透析袋內(nèi)液冷凍干燥得F-A、F-B、F-C、F-D。用Sephaeryl S-300凝膠層析柱(1.6cm×80cm)進(jìn)一步分離F-C，同時(shí)用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進(jìn)行檢測(cè)，最終得到均一多糖組分TC-1。

1.5 多糖純度及其相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)。樣品及系列標(biāo)準(zhǔn)多糖(不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖：Mw分別為11600、66700、123600、196300、500000)分別流經(jīng)Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)中TSKG 5000PWXL色譜柱，流動(dòng)相為0.1mol/L NaNO3溶液，流速為0.5mL/min，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。由標(biāo)準(zhǔn)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及Agilent GPC軟件計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量及分布，樣品純度由峰型判斷。

1.6 單糖組成分析[10]

取多糖樣品2～3mg置于5mL安瓿瓶中，加2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL，封管，120℃水解2h。旋蒸除盡溶液中的TFA，之后加入少量蒸餾水，取5μL進(jìn)行薄層分析。用乙酸乙酯、吡啶、水、乙酸(體積比為5:5:3:1)的混合液展開劑展開后，苯胺-鄰苯二甲酸顯色，所得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照。水解產(chǎn)物另一部分，室溫下加入NaBH4，反應(yīng)2h(間隙振蕩)，生成糖醇乙酰酯衍生物，進(jìn)行GC-MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖醇全乙?；苌?制備方法同多糖樣品，但勿需TFA水解)作對(duì)照。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號(hào)：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比20:1；進(jìn)樣量0.2μL；采取程序升溫：初始溫度/停頓時(shí)間為150℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時(shí)間為220℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.7 甲基化分析

根據(jù)Needs等[11]法對(duì)多糖樣品進(jìn)行甲基化，IR檢測(cè)產(chǎn)物無羥基特征吸收峰，表明其甲基化完全。將完全甲基化的多糖樣品溶于90%甲酸水溶液，密塞，100℃水浴解聚6h，除盡甲酸后，加入2mol/L TFA，120℃密封水解2h后除去過量TFA。固體殘?jiān)?jīng)NaBH4還原、乙?；频貌糠旨谆陌柕洗家宜狨パ苌铮M(jìn)行GC-MS分析。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號(hào)：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比3:1；進(jìn)樣量1μL(氯仿為溶劑)；采取程序升溫：初始溫度/停頓時(shí)間為120℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時(shí)間250℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.8 紅外光譜(IR)分析及元素分析

取1～2mg樣品，KBr研磨壓片后進(jìn)行IR分析，甲基化后的樣品采用衰減全反射ATR附件測(cè)定IR吸收。采用IR吸收法、vario EL Ⅲ型元素分析儀檢測(cè)樣品是否含有硫酸根及硫酸根的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TC-1的分離純化

圖1 巖藻多糖的DEAE-纖維素柱色譜分離Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extracted from kelp on DEAE-cellulose column

如圖1所示，各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當(dāng)體積，用蒸餾水透析，透析袋內(nèi)液冷凍干燥所得產(chǎn)物，分別命名為F-A、F-B、F-C、F-D，4個(gè)組分多糖總量分別為35、610、690、18mg。

多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量，因?yàn)槎嗵鞘且环N生物高分子化合物，其存在微觀不均一性。多糖的純度代表是某一多糖的相似鏈長的平均分布。目前通常采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)對(duì)多糖進(jìn)行純度檢測(cè)。一般來說，在凝膠柱填料的排阻極限內(nèi)，HPGFC譜中呈現(xiàn)窄的單一對(duì)稱峰的多糖組分可被認(rèn)為是均一多糖。檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)-A、F-B、F-C、F-D都不純，均需要進(jìn)一步分離純化才能得到均一多糖。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)F-C部分作進(jìn)一步分離純化，色譜圖見圖2。

圖2 F-C的凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatogram of F-C

根據(jù)GPC軟件計(jì)算可知F-C部分可能含有兩種多糖組分，根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量分布，選擇Sephacryl S-300作為凝膠層析介質(zhì)(1.6cm×80cm)進(jìn)行純化。采用苯酚-硫酸法和HPGFC同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，得到均一多糖TC-1，其色譜圖見圖3。以已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖制作校正曲線，根據(jù)多糖樣品的保留時(shí)間，由GPC軟件計(jì)算出TC-1的重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw為3.7×105，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn為3.0×105。

圖3 TC-1的凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatogram of TC-1

2.2 TC-1的紅外光譜分析

由圖4可知，3421cm-1處強(qiáng)吸收峰為O-H伸縮振動(dòng)峰；2926cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1645cm-1處為糖環(huán)的伸縮振動(dòng)峰；1258cm-1附近處是由硫酸基S＝O伸縮振動(dòng)引起的，證明了TC-1是含有硫酸基取代的多糖；1084cm-1處為C-O的伸縮振動(dòng)峰；848cm-1為C-O-S(直立鍵)的伸縮振動(dòng)峰，硫酸基連接在糖環(huán)的C4位上；此外在1720cm-1附近未檢測(cè)到吸收峰，說明不含有糖醛酸；在810cm-1及870cm-1處無吸收，說明可能不含甘露糖[12]。

圖4 TC-1的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of TC-1

2.3 TC-1單糖組成分析

TC-1以2mol/L TFA 120℃水解后的產(chǎn)物進(jìn)行纖維素薄層層析(TLC)，以標(biāo)準(zhǔn)單糖為對(duì)照，苯胺-鄰苯二甲酸噴霧顯色后顯示有巖藻糖(棕色斑點(diǎn))﹑木糖(紅色斑點(diǎn))、甘露糖(紅色斑點(diǎn))、半乳糖(棕色斑點(diǎn))和葡萄糖(棕色斑點(diǎn))的存在，另外，在Rf值等同于標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸的位置處未發(fā)現(xiàn)紅棕色斑點(diǎn)，說明TC-1不含有半乳糖醛酸成分，與上述的紅外結(jié)果一致。

圖5 TC-1的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of TC-1

為證實(shí)TLC的結(jié)果，另取TC-1用2mol/L TFA120℃水解2 h，經(jīng)硼氫化鈉還原，乙酸酐乙酰化后，衍生物進(jìn)行GC-MS分析，如圖5所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖相應(yīng)衍生物的保留時(shí)間(圖6)比較，得知TC-1主要含有巖藻糖，伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為17.3:1.0:2.6:3.8:5.1。通過IR測(cè)定，1240cm-1吸收峰是S＝O伸縮振動(dòng)特征吸收峰，830cm-1是C-O-S振動(dòng)的特征頻率[13]，元素分析法測(cè)得的硫酸基含量為22.4%，印證了巖藻多糖是含有相當(dāng)數(shù)量的巖藻糖(fucose)和硫酸基的多糖[14]。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.4 TC-1的甲基化分析

TC-1完全甲基化產(chǎn)物經(jīng)90%甲酸解聚、TFA水解、硼氫化鈉還原及乙酰化后制得部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯衍生物后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見表1。

表1 TC-1甲基化分析結(jié)果Table1 Methylation analysis of reduced TC-1

由表1可知，巖藻糖殘基存在1,4-、1,3-兩種連接方式，主要以1,3連接方式為主；木糖殘基以1,2-連接方式存在；甘露糖有1,3-、1,6-兩種連接方式；葡萄糖存在1,3,4-、1,2,4、6-兩種連接方式；半乳糖有1,6-、1,3,6-、1,3,4,6- 3種連接方式。

綜合以上的分析結(jié)果，TC-1為重均相對(duì)分子質(zhì)量為3.7×105，硫酸基含量為22.4%，由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的復(fù)雜硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-的連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

3 討 論

關(guān)于海帶中巖藻多糖的組成[15]國內(nèi)外已有報(bào)道。程忠玲[13]報(bào)道海帶中提取的褐藻糖膠為一種水溶性雜聚糖，其主要原始成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯，以及少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子。L-巖藻糖-4-硫酸酯的結(jié)構(gòu)特征是1,2-連接的聚α-L-吡喃巖藻糖。主鏈由巖藻糖組成，在巖藻糖上含有大量的硫酸基。李林等[16]研究發(fā)現(xiàn)海帶中的褐藻糖膠是由鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fvc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物，其中單糖的物質(zhì)的量比為Rha:Fuc: Xyl: Man: Gal: Glu=0.41:1.72:3.75:0.96:1:2.17。褐藻糖膠的葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)的含量分別為6.2%、8.7%和4.1%。與這些報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)從海帶中獲得的TC-1的單糖組成與它們有所不同，為其在生物活性多樣性方面[17]的研究應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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Isolation, Purification and Structural Analysis of Fucoidan from Kelp

ZHANG Wen-qing，ZUO Ping-ping，XU Chen，YANG Lei，ZHANG Yu-long，XIA Wei*
(Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

A homogeneous polysaccharide named as TC-1 was obtained from kelp by DEAE-cellulose and gel filtration chromatography. Its chemical structure was characterized by means of monosaccharide composition analysis, methylation analysis and IR spectroscopic analysis. TC-1 was a complex sulfated polysaccharide with a weight-average molecular weight of 3.7 × 105. TC-1 mainly consisted of fucose and small amounts of xylose, mannose, glucose and galactose were also found. The chain of TC-1 included 1,4-linked or 1,3-linked fucose, 1,3-linked xylose, 1,3-linked or 1,6-linked mannose, 1,3,4-linked or 1,2, 4,6-linked glucose, and 1,6- linked,1,3,6- linked, or 1,3,4,6- linked galactose.

kelp；fucoidan；isolation and purification；structural analysis

O636.1

A

1002-6630(2012)01-0068-04

2011-01-14

張文清(1969—)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及功能材料的研究。E-mail：zhwqing@ecust.edu.cn

*通信作者：夏瑋(1976—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn