秦嘉炎，于 娜，岳喜慶*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

酶法水解卵黃蛋白制備多肽的工藝優(yōu)化

秦嘉炎，于 娜，岳喜慶*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

利用酶法制備卵黃蛋白多肽。比較復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶水解卵黃蛋白的效果，確定堿性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶為復(fù)合酶解的工藝用酶。采用響應(yīng)面分析法，以水解度、多肽含量為響應(yīng)值，研究加酶量、酶用量比、復(fù)合酶解時(shí)間比、pH值對(duì)制備多肽工藝的影響。結(jié)果表明：酶法水解卵黃蛋白制備多肽的最佳工藝條件為：卵黃蛋白質(zhì)量濃度10g/100mL、溫度55℃、pH7.2，按0.8g/100mL添加堿性蛋白酶水解2h后，再按0.4g/100mL添加復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解2h，在該條件下水解度和多肽含量分別為(13.31±0.5)%和(1.85±0.5)mg/mL。

卵黃蛋白；多肽；酶解；響應(yīng)面

雞蛋作為一種完全食品，是人類健康、廉價(jià)、全價(jià)的重要蛋白來源，被人們譽(yù)為維持生命的營養(yǎng)食品[1]。雞蛋黃是雞蛋中營養(yǎng)價(jià)值最為豐富的一部分，蛋白質(zhì)含量高，約占其總量的16%，且含有大量的生理活性物質(zhì)，其生物學(xué)及生化性質(zhì)相當(dāng)引人注目，是食物中理想的蛋白質(zhì)。雞蛋黃生理功能成分的開發(fā)已成為國內(nèi)外的研究焦點(diǎn)[2-3]。20世紀(jì)以來，許多學(xué)者已從雞蛋黃中分離得到了多肽，目前已發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白活性肽具有抗氧化[4]、降血壓[5-6]、促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收[7]等多種生理功能，可廣泛地應(yīng)用于食品、保健品和醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域[8]，極具開發(fā)前景。為充分利用我國的禽蛋資源并提高它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)其進(jìn)行深加工研究顯得尤為重要。目前，國內(nèi)外研究多是從實(shí)驗(yàn)室的角度采用酶水解卵黃蛋白制備生物活性肽，但簡便、易行、高產(chǎn)、低耗、高效的卵黃蛋白活性肽制備方法仍然是活性肽開發(fā)利用中一個(gè)亟待解決的問題。

本實(shí)驗(yàn)以卵黃蛋白為原料，利用多種蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，并以水解度和肽含量為指標(biāo)，研究酶法水解卵黃蛋白制備多肽的工藝，旨在為雞蛋黃蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵黃蛋白(蛋白質(zhì)含量72.5%) 自制。

堿性蛋白酶(Alcalase，酶活力2.4AU/g)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme，酶活力500LAPU/g)、中性蛋白酶(Neutrase，酶活力0.8 A U/g)、復(fù)合蛋白酶(Protamex，酶活力1.5AU/g) 丹麥Novo公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；CR-21G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；85-2型恒溫磁力攪拌器 杭州國華電器有限公司；UV-2100型分光光度計(jì) 龍尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定

采用凱氏定氮法[9]。

1.3.2 游離氨基氮含量測定

采用甲醛電位滴定法[10]。

1.3.3 水解度(DH)測定

參照文獻(xiàn)[11-12]的方法。

式中：h為水解后每克卵黃蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)/(mmol/g)；htot為每克卵黃蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)/ (mmol/g)。

1.3.4 多肽含量的測定[13]

用10g/100mL三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白質(zhì)，經(jīng)離心過濾后，在上清液中加入雙縮脲試劑，于540nm波長處測定其OD值，繼而在Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中的多肽含量。

1.3.5 卵黃蛋白的酶解工藝

準(zhǔn)確稱取一定量卵黃蛋白，加入適量蒸餾水配制成10g/100mL的底物質(zhì)量濃度。經(jīng)預(yù)處理(90℃加熱10min)后冷卻至設(shè)定溫度，調(diào)節(jié)pH值至反應(yīng)值，加入一定量的酶，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，將酶解液在90℃條件下滅酶10min，然后于4000r/min離心10min，取上清液即為卵黃蛋白酶解液。

1.3.6 復(fù)合酶解最佳條件的確定

1.3.6.1 蛋白酶的篩選

取10g/100mL卵黃蛋白溶液100mL，分別加入堿性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶4種蛋白酶，并在其各自的最適溫度、pH值、加酶量的條件下，分別水解4h。通過測定酶解液的水解度和多肽含量，確定適于水解卵黃蛋白的蛋白酶。

1.3.6.2 加酶方式的確定

選取兩種酶解效果較好的酶制劑進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)，以研究加酶方式對(duì)酶解效果的影響。在確定兩種蛋白酶適宜水解條件的基礎(chǔ)上，將卵黃蛋白溶液質(zhì)量濃度確定為10g/100mL，酶解溫度55℃，復(fù)合酶解時(shí)間各為2h，在各自的最適加酶量、pH值條件下，考察協(xié)同水解和分步水解時(shí)兩種加酶方式對(duì)酶解效果的影響。試圖通過兩種酶的復(fù)配，增加卵黃蛋白酶解液中多肽的含量和提高水解度，并改善卵黃蛋白酶解液的風(fēng)味。

1.3.6.3 加酶量的確定

酶Ⅰ(堿性蛋白酶)的確定：在底物質(zhì)量濃度10g/100mL、溫度55℃、pH7.0、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加量0.4g/100mL、酶解2h的條件下，測定堿性蛋白酶不同添加量為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6g/100mL時(shí)，測定酶解液的水解度和多肽含量。

酶Ⅱ(復(fù)合風(fēng)味蛋白酶)的確定：確定酶Ⅰ加酶量。固定其他條件，測定復(fù)合風(fēng)味蛋白酶不同添加量為0.2、0.4、0.6、0.8g/100mL時(shí)，酶解液的水解度和多肽含量，以確定最佳總加酶量。

1.3.6.4 復(fù)合酶酶用量比的確定

在底物質(zhì)量濃度10g/100mL、總加酶量1.2g/100mL、溫度55℃、pH7.0、酶解時(shí)間各2h的條件下，測定m酶Ⅰ:m酶Ⅱ?yàn)?:1、2:1、1:1、1:2、1:3時(shí)，測定酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.6.5 酶解時(shí)間比的確定

在底物質(zhì)量濃度10g/100mL、總加酶量1.2g/100mL、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ?yàn)?:1、溫度55℃、pH7.0的條件下，測定t酶Ⅰ:t酶Ⅱ?yàn)?:2、1:3、2:1、2:2、3:1時(shí)，測定酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.6.6 初始pH值的確定

在底物質(zhì)量濃度10g/100mL、總加酶量1.2g/100mL、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ?yàn)?:1、溫度55℃、酶解時(shí)間各2h的條件下，初始pH值為6.0、7.0、8.0、9.0時(shí)，酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.7 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-15]

根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取堿性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解的m酶Ⅰ:m酶Ⅱ、pH值、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以水解度和多肽含量為響應(yīng)變量對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的確定

表2 4種蛋白酶水解效果的對(duì)比Table 2 Comparative effectiveness of four proteases in hydrolyzing egg yolk protein

由表2可知，4種蛋白酶水解卵黃蛋白的效果不同，其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的水解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另外3種酶，酶解液無明顯苦味、腥味，但水解產(chǎn)物中多肽含量相對(duì)較低；3種內(nèi)切酶中，無論是從水解度還是肽含量考察，堿性蛋白酶的酶解效果最好，復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶次之，3種酶的水解產(chǎn)物均有苦腥味，且隨著酶解時(shí)間的延長和水解度的提高，苦腥味不同程度地增強(qiáng)，這可能與酶切位點(diǎn)及卵黃蛋白中的氨基酸組成有關(guān)。通過比較研究，選用酶Ⅰ(堿性蛋白酶)和酶Ⅱ(復(fù)合風(fēng)味蛋白酶)作為復(fù)合酶解的組合。

2.2 加酶方式對(duì)水解效果的影響

表3 復(fù)合酶解卵黃蛋白的不同酶解方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for dual-enzymatic hydrolysis of egg yolk protein

由表3可知，酶Ⅰ、酶Ⅱ先后加入復(fù)合使用其水解度和多肽含量較高，酶解效果較其他方式好，離心分離后，上清液呈亮黃色、較澄清，酶解液的風(fēng)味得到明顯改善?？梢娺@兩種蛋白酶對(duì)卵黃蛋白的水解有互補(bǔ)作用。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用先酶Ⅰ后酶Ⅱ分步水解的方式水解卵黃蛋白。

2.3 加酶量對(duì)水解效果的影響

圖1 堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of egg yolk protein

由圖 1a 可知，水解度及肽含量隨著酶Ⅰ添加量增加而增加。當(dāng)加酶量大于0.8g/100mL時(shí)，水解度及肽含量增勢(shì)緩慢，且隨加酶量的增加，酶解液的顏色加深，腥味加重。綜合考慮成本和酶解效果等因素，選擇酶Ⅰ添加量為0.8g/100mL。

由圖1b可知，酶Ⅱ添加量對(duì)水解度和肽含量的影響不同。當(dāng)酶Ⅱ添加量在0.2～0.4g/100mL時(shí)，水解度不斷上升，肽含量達(dá)到較高水平；當(dāng)加酶量超過0.4g/100mL時(shí)，水解度增加緩慢，多肽含量有所下降。這可能是因?yàn)槊附夂笃冢涪蛑饕援a(chǎn)物中存在的肽為底物，釋放出更小分子質(zhì)量的肽和氨基酸，使肽含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜合各方面因素，選擇0.4g/100mL為酶Ⅱ最適添加量，即總加酶量為1.2g/100mL。

2.4 復(fù)合酶酶用量比對(duì)酶解效果的影響

圖2 酶用量比對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of alcalase-to-flavourzyme ratio on the hydrolysis of egg yolk protein

由圖2可知，不同酶用量比對(duì)酶解液的水解度、肽含量影響較大。當(dāng)m酶Ⅰ:m酶Ⅱ?yàn)?:1時(shí)，整體酶解效果較好，酶解液的風(fēng)味得到明顯改善。綜合考慮酶解效果和酶解風(fēng)味等因素，選擇2:1為酶Ⅰ與酶Ⅱ的固定酶用量比。

2.5 酶解時(shí)間比對(duì)酶解效果的影響

由圖3可知，當(dāng)t酶Ⅰ:t酶Ⅱ?yàn)?:2時(shí)，水解度及肽含量均達(dá)到較高水平，酶解效果較好。綜合考慮能耗、生產(chǎn)周期及酶解液的風(fēng)味等因素，選擇2:2為酶Ⅰ與酶Ⅱ的最適酶解時(shí)間比。

圖3 復(fù)合酶解時(shí)間比對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of duration ratio between two hydrolysis steps on the hydrolysis of egg yolk protein

圖4 pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis of egg yolk protein

2.6 初始 pH值對(duì)酶解效果的影響由圖 4可知，初始 pH值為 7.0～8.0時(shí)，酶解效果較好。但是pH值從7.0上升到8.0肽含量增幅較小，而且在實(shí)際生產(chǎn)中pH值的升高會(huì)增加脫鹽的成本，因此確定初始pH值為7.0。

2.7 響應(yīng)曲面法優(yōu)化水解條件

2.7.1 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。應(yīng)用MiniTab15計(jì)算機(jī)軟件對(duì)表4中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，表5、6為方差分析結(jié)果，表明該模型回歸顯著。

表5 水解度回歸方程的方差分析Table 5 Variance analysis for the developed regression equation for DH

表6 肽含量回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis for the developed regression equation for polypeptide content

各因素經(jīng)過回歸擬合后，得到水解度(Y1)、肽含量(Y2)與三因素的二次多項(xiàng)回歸方程分別為：Y1=12.9967＋0.833X1＋1.14613X2＋0.332625X3－0.894333X12－2.16558X22－1.25708X32－0.77725X1X2＋0.65775X1X3－1.076X2X3；Y2=1.80733＋0.114X1+0.176625X2+ 0.021125X3－0.146042X12－0.286292X22－0.161292X32－0.111X1X2＋0.095X1X3－0.18625X2X3。

由表5、6可知，以水解度和肽含量為響應(yīng)值時(shí)，兩個(gè)回歸方程的P值均小于0.01，模型的決定系數(shù)分別為0.9674和0.9866，說明方程的因變量與自變量之間的回歸效果顯著，可以對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測。失擬項(xiàng)均不顯著，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小。

2.7.2 響應(yīng)曲面分析

由均方分析可見，影響水解度、肽含量的三因素主次順序均為pH值(X2)、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ(X1)、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ(X3)。根據(jù)回歸分析結(jié)果，可得到相應(yīng)的曲面圖，分別從中選取有代表性的兩組，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各因素對(duì)水解效果影響的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of threeprocess parameters on the hydrolysis of egg yolk protein

2.8 酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化及驗(yàn)證

運(yùn)用Minitab軟件的響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到水解度最高為13.31%的優(yōu)化組合：X1=0.478、X2=0.131、X3=0.192，即酶Ⅰ與酶Ⅱ的添加量分別為0.85g/100mL和0.35g/100mL，pH7.13、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ?yàn)?.2:1；最高肽含量1.85mg/mL的優(yōu)化組合：X1=0.230、X2= 0.253、X3=0.010，即酶Ⅰ與酶Ⅱ的添加量分別為0.68g/100mL和0.52g/100mL，pH7.25、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ?yàn)?.01:1。綜合各因素的影響大小和實(shí)際操作的便利，將工藝參數(shù)修正為：酶Ⅰ與酶Ⅱ的添加量分別為0.8g/100mL和0.4g/100mL、pH7.2、時(shí)間各2h、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、溫度55℃。根據(jù)上述優(yōu)化調(diào)整后的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果水解度為(13.31 ± 0.5)%、肽含量為(1.85 ± 0.5)mg/mL。實(shí)際值與預(yù)測值一致，說明預(yù)測條件與實(shí)際情況符合?？梢?，該模型可以較好的反映卵黃蛋白酶解的工藝條件，具有合理性和適用性。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過比較復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合蛋白酶對(duì)卵黃蛋白的酶解效果，最終確定堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶為復(fù)合酶解的較佳工藝用酶。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度10g/100mL、溫度55℃、pH7.2，按先添加0.8g/100mL堿性蛋白酶水解2h后，再添加0.4g/100mL復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解2h。該條件下水解度和多肽含量分別為(13.31±0.5)%和(1.85±0.5)mg/mL。

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Process Optimization for Enzymatic Preparation of Polypeptides from Egg Yolk Protein

QIN Jia-yan，YU Na，YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

In this study, enzymatic hydrolysis was used to prepare polypeptides from egg yolk protein. Two-step hydrolysis with alkaline protease and flavourzyme was found optimal for preparing polypeptides from egg yolk protein as demonstrated by a comparison of the effectiveness of flavourzyme, neutral protease, alcalase and protamex in hydrolyzing egg yolk protein. The response surface methodology was employed to investigate the effects of total enzyme dosage, alcalase-toflavourzyme ratio, duration ratio between two hydrolysis steps and pH on degree of hydrolysis (DH) and polypeptide content. The optimal hydrolysis process was hydrolysis for 2 h with 0.8 g/100 mL alcalase at 55 °C, pH 7.2 and a substrate concentration of 10 g/100 mL and for another 2 h with 0.4 g/100 mL flavourzyme, resulting in a DH of (13.31± 0.5)% and a polypeptide content of (1.85 ± 0.5) mg/mL.

egg yolk protein；polypeptides；enzymatic hydrolysis；response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0147-05

2011-02-13

秦嘉炎(1986—)，女，碩士研究生，主要從事動(dòng)物性食品加工研究。E-mail：qinjiayan811026@163.com

*通信作者：岳喜慶(1966—)，男，教授，博士，主要從事動(dòng)物性食品加工研究。E-mail：yxqsyau@126.com