李水根 姚江武，2

（1.福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)院 修復科，福州350002；2.廈門市口腔醫(yī)院 修復科，廈門361003）

在日常生活中，茶、紅酒和食用色素是天然牙最易接觸到的著色物。茶黃素（theaflavin，TF）、姜黃素（curcumin，Cur）和矢車菊素（cyanidin，Cy）是分別來自于茶葉、姜黃和葡萄的提取物，廣泛應用于食品添加劑中[1]。作為色源體的天然色素與人全唾液（whole saliva，WS）作用，可以沉積于牙面形成色漬，還可以與唾液蛋白結合，抑制蛋白質的活性，使口腔黏膜產生干燥和皺縮感[2]。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術可以將蛋白質分子自組裝于SPR傳感器芯片表面，特別適合于研究聚合物高分子與蛋白質之間的相互作用。本研究利用SPR技術，將WS自組裝于芯片表面，考察色素TF、Cur和Cy吸附于WS表面的動態(tài)全過程，分析色素與WS蛋白質分子之間的相互作用和親合力，探討物體表面著色物形成和干燥及皺縮感產生的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器及試劑

SR7000DC型SPR儀（Reichert公司，美國）、Biofuge Fresco型低溫離心機（Heraeus公司，德國）、Millipore Direct-Q3超純水器（Millipore公司，法國）。高純度的TF、Cur和Cy，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（日本西寶生物科技有限公司）。11-巰基十一烷酸（11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA），1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]，N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），牛血清白蛋白，緩沖液（phosphate buffer solution，PBST）；上述試劑均為美國Sigma公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 WS的收集和蛋白質量濃度的測定 收集WS的具體步驟詳見參考文獻[3]。收集完成后采用Bradford法測定WS蛋白的質量濃度，測定步驟詳見參考文獻[4]。

1.2.2 自組裝WS膜 SPR芯片置于60 ℃的10 mmol·L-111-MUA/純乙醇溶液中24 h，取出后用純乙醇沖洗，氮氣吹干。通入1 mL的體積比為1∶1的0.2 mol·L-1EDC和0.1 mol·L-1NHS的混合溶液，活化SPR芯片10 min，然后注入1 mL的WS溶液至吸附達到穩(wěn)態(tài)，再注入1 mol·L-1pH8.5的乙醇胺鹽酸溶液1 mL，維持10 min，形成WS自組裝單分子膜（self-assembled monolayer，SAM）[5]。

1.2.3 SPR動態(tài)監(jiān)測 在25 ℃條件下，將色素溶解于pH值為6.8的DMSO中，并以10 mmol·L-1PBST稀釋成不同濃度（0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mmol·L-1）的溶液，以5 μL·min-1的流速分別注入芯片，30 min后色素吸附達到穩(wěn)態(tài)。實時記錄傳感圖譜。

1.2.4 吸附動力學公式 本研究選擇兩個吸附動力學公式，Langmuir公式[6]和Freundlich公式[7]，二者分別為C/M=1/KLMm+C/Mm和logM=logKf+1/n logC。式中C是被吸附溶液的濃度；M是吸附量；KL是Langmuir吸附常數(shù)，反映吸附過程的強度；Mm為飽和狀態(tài)的最大吸附量；1/n是常數(shù)；Kf是Freundlich吸附常數(shù)，意義同KL。以C/M對C和logM對logC作圖，求得直線的斜率和截距，進而求得吸附等溫線常數(shù)：KL、Mm和Kf。

SPR芯片上配體與分析物反應的速率公式[8]：dR/dt=kaCRmax-（kaC+kd）R。上式中C為分析物的濃度，Rmax為芯片上形成最多復合物時所得到的響應，R為在時間t時所得到的響應。以dR/dt對R作圖可得到一條直線，其斜率為表觀吸附常數(shù)Kobs，且Kobs=-（kaC+kd）。以-Kobs對C作圖，同樣可以得到一條直線，斜率即為結合速率常數(shù)ka，截距為解離速率常數(shù)kd。結合平衡常數(shù)KA=ka/kd，解離平衡常數(shù)KD=kd/ka[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對Langmuir和Freundlich吸附等溫線的相關決定系數(shù)（R2）進行配對t檢驗；采用單因素方差分析比較不同色素對WS的吸附動力學常數(shù)總體均數(shù)之間的差異，SNK-q檢驗用于均數(shù)間的兩兩比較，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 WS蛋白的質量濃度

采用Bradford法測定WS蛋白的質量濃度的平均值為1.043 g·L-1。

2.2 吸附模型R2的比較

圖1為在25 ℃、pH值為6.8、10 mmol·L-1PBST的緩沖體系下，不同濃度的3種色素吸附于WS表面達到穩(wěn)態(tài)后所記錄的響應強度與時間的關系曲線。伴隨著色素濃度的增大，響應值不斷增大，提示吸附量不斷增多。圖2表示色素吸附于WS表面的Langmuir和Freundlich等溫線和表觀吸附常數(shù)Kobs與色素濃度的關系曲線。Langmuir模型下R2值為：TF為0.920 0±0.040 3、Cur為0.926 8±0.037 0、Cy為0.980 3±0.003 0；Freundlich模型下R2值為：TF為0.983 1±0.010 6、Cur為0.994 7±0.003 9、Cy為0.997 7±0.019 0。配對t檢驗結果為：兩種模型下，TF、Cur和Cy的R2值之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的色素對WS生物膜表面吸附的響應強度與時間的關系曲線Fig 1 The curves of response versus time for the interactions of pigments with WS at various pigment concentrations

圖2 色素吸附于WS表面的動力學曲線Fig 2 The kinetic curves for pigments adsorption onto WS surface

2.3 吸附動力學常數(shù)的比較

根據(jù)圖2及吸附動力學公式求得常數(shù)KL、Mm和Kf及其統(tǒng)計學結果見表1。方差分析結果表明：KL值之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示采用Langmuir模型采集的3種色素的吸附強度值相同；采用兩種模型采集的Mm和Kf值之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即TF＞Cur＞Cy。

表1 3種色素的吸附動力學常數(shù)KL、 Mm和Kf的比較Tab 1 Comparison of adsorption kinetic constants KL,Mm and Kf for three kinds of pigments

2.4 速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較

速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計結果見表2：結合速率常數(shù)ka和結合平衡常數(shù)KA，其結果均為TF＞Cur＞Cy（P＜0.05），解離速率常數(shù)kd和解離平衡常數(shù)KD則是Cy＞Cur＞TF（P＜0.05），表明反應速率的變化趨勢與Freundlich模型采集的吸附強度和親和力趨勢一致。

表2 3種色素吸附于WS表面的速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較Tab 2 Comparison of constants of rate and equilibrium for three kinds of pigments

3 討論

3.1 唾液SAM

SAM是分子通過化學鍵相互作用自發(fā)吸附在固/液或氣/液界面，形成熱力學穩(wěn)定、能量最低的有序膜。在本實驗中，11-MUA末端的羧基在以EDC為催化劑的條件下與NHS反應，轉換為N-羥基琥珀酰亞胺酯，從而與唾液蛋白分子中的氨基反應形成共價鍵結合，將蛋白質固定在固體表面。

3.2 吸附模型

本實驗中色素對WS膜的Langmuir和Freundlich等溫式的相關決定系數(shù)R2的配對t檢驗表明，F(xiàn)reundlich模型的R2值均大于Langmuir模型的R2值，且差異具有統(tǒng)計學意義，提示Freundlich模型更適合于描述本實驗的吸附反應。同時Langmuir模型的3種色素的吸附常數(shù)值（KL）相同，而Freundlich模型的吸附常數(shù)值（Kf）不相同，進一步表明吸附過程采用經驗的Freundlich模型描述更為準確。

3.3 親和力

由表1可知，F(xiàn)reundlich模型中反映相互作用的親和力的動力學常數(shù)Kf值為TF＞Cur＞Cy，這表明茶黃素與唾液的親和力最強，姜黃素次之，矢車菊素最小。速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計結果表明：茶黃素吸附于唾液表面的速度最快，且達到平衡狀態(tài)的時間最短，姜黃素次之，矢車菊素最慢。色素吸附于唾液表面的親和力的結果與吸附等溫式的線性相關分析結果一致。在本研究中的3種酚式色素的分子結構中，茶黃素芳香環(huán)上有9個-OH，姜黃素有3個-OH和2個甲氧基，矢車菊素有5個-OH。理論上甲氧基比-OH具有更強的極性，能夠在蛋白質分子與酚式色素間形成羰氫鍵連接，進而具有親核加成能力[10]。由于姜黃素芳香環(huán)上的甲氧基的極性比矢車菊素分子結構中-OH的略大，因此，姜黃素的穩(wěn)定性和生物活性強于矢車菊素，最終導致其在吸附反應中對唾液蛋白質的親和力大于矢車菊素。當色素吸附于唾液蛋白質分子的表面時，由于存在質子轉移，酚式色素上的-OH與唾液蛋白分子上的H+結合位點發(fā)生氫鍵結合[11]。綜上所述，茶黃素芳香環(huán)上的-OH最多，故而生物活性最強，姜黃素次之，矢車菊素最弱。由此可見，酚式色素的生物活性隨著其分子結構中羥基數(shù)量的增加而加強，這一結論與以往的研究結果相一致[12]。

本實驗通過對人唾液與色素之間的相互作用的動力學研究，建立了唾液和色素生物膜的體外分子模型，將色素吸附于唾液表面的研究深入到分子水平。動力學研究表明：唾液蛋白與色素之間的作用驅動力源自氫鍵反應。該模型的建立將有助于對牙著色機制進行深入研究，為預防牙著色的形成和改善牙的美觀以及了解口腔黏膜表面產生干燥和皺縮感的生理學機制奠定實驗依據(jù)。今后尚需在此動力學研究的基礎上，考察不同的生理條件（溫度、pH值和離子強度）下，色素對唾液蛋白構象和生化特性的影響。

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