劉小獻,白俊杰,于凌云,李勝杰

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院,遼寧大連116023;2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室,廣州510380)

草魚載脂蛋白A-I-1基因3'非編碼區(qū)SNPs篩選及其與生長性狀的關聯(lián)分析

劉小獻1、2,白俊杰2,于凌云2,李勝杰2

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院,遼寧大連116023;2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室,廣州510380)

采用PCR產(chǎn)物直接測序法和PCR-RFLP法對草魚EST文庫中載脂蛋白A-I-1基因(Apoprotein A-I -1,apoA-I-1)3'非編碼區(qū)進行SNPs篩選,在珠江水系草魚Ctenopharyngodon idella養(yǎng)殖群體144個樣本中發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點。C792T位點的CC型占46.53%,CT型占50.69%,TT型占2.78%;G851A位點的GG型占77.08%,GA型占20.83%,AA型占2.08%。采用一般線性模型對2個SNPs位點與草魚4個生長性狀——體質量、體長、體高和頭長進行關聯(lián)分析,結果表明:C792T位點TT型個體的體質量、體長、體高和頭長均值高于CT型和CC型個體的生長性狀指標值,但未達到顯著水平(P＞0.05);G851A位點GG型個體的體質量、體長、體高和頭長均值高于GA型和AA型個體的生長性狀指標值,且GG型個體的體長和頭長均值與GA型和AA型個體均存在顯著差異(P＜0.05)。將2個SNPs位點不同基因型組合成6種雙倍型,關聯(lián)分析結果表明,雙倍型D3(TTC792T-GGG851A)個體的體質量均值最高,D6型(CCC792TAAG851A)個體的體質量均值最低,且二者在體長、體高、頭長均值間存在顯著差異(P＜0.05)。推測C792T位點TT型為有利基因型;G851A位點GG型為有利基因型,AA型為不利基因型。本研究結果為草魚分子輔助育種提供了候選標記,為加快草魚育種進程奠定了基礎。

草魚;SNP;載脂蛋白A-I;apoA-I-1;生長性狀;雙倍型;關聯(lián)分析

草魚Ctenopharyngodon idella隸屬于鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、草魚屬,是中國淡水養(yǎng)殖四大家魚之一,有著重要的經(jīng)濟價值。由于草魚親魚的個體大、性成熟周期長,給其良種選育帶來了困難,目前尚未獲得遺傳改良的品種或品系。利用DNA遺傳標記進行輔助選育已成為動物育種過程中的重要方法[1]。篩選并利用與草魚經(jīng)濟性狀相關的分子標記,可有效提高選擇效率,縮短育種年限,對加快培育具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的草魚養(yǎng)殖品系具有重要的意義。

魚類能量主要來源于脂類,脂類代謝在魚類的能量代謝及生長過程中有著重要的作用。載脂蛋白A-I(Apoprotein A-I,簡稱apoA-I)是硬骨魚類血漿蛋白中高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)的重要組成成分,在逆向轉運膽固醇過程中具有重要作用[2],對魚類生長存在潛在的作用。一些學者在對鯉、虹鱒和斑點叉尾鮰的研究中發(fā)現(xiàn),apoA-I還存在潛在的抗菌活性,具有部分免疫功能,對魚類的健康生長具有一定的保護作用[2-4]。本試驗中,作者采用PCR產(chǎn)物直接測序法和PCR-RFLP法對草魚EST文庫中載脂蛋白A-I-1基因(Apoprotein A-I-1,apoA-I-1)3'非編碼區(qū)SNPs位點進行篩選,以期為草魚分子標記輔助育種提供候選標記。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用草魚取自廣東省佛山市三水白金水產(chǎn)種苗有限公司,為同批繁殖且同塘養(yǎng)殖的20月齡草

魚群體,樣本數(shù)量為144尾,體質量均值為1 292.5 g。親本來自珠江水系。

Taq DNA聚合酶、buffer和dNTP購自華美生物工程公司,限制性內(nèi)切酶BseGI和MspI購自Fermentas公司,瓊脂糖、去離子甲酰胺丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺等購自廣州威佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用尾靜脈活體取血,抗凝劑(ACD)與血液體積比為6∶1,使用天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)血液基因組提取試劑盒提取DNA,樣本于-20℃下保存。

1.2.2 引物設計及合成 根據(jù)草魚EST-SNPs數(shù)據(jù)庫中apoA-I-1基因cDNA序列設計引物,擴增含SNPs位點的序列,引物序列如下:

PF:GGAGAACTGAGGAAAAAGATGACCG;

PR:TTTATTCATATCTGTGTTTGCCCATTAG,由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.3 SNPs篩選及基因型的檢測 從144個草魚DNA樣本中隨機挑選20個樣本,用引物PF和PR對其進行PCR擴增。PCR反應體積為20 μL,包括10×PCR buffer 2.0 μL,dNTP(10 mmol/L)0.3 μL,Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL,基因組DNA(80 ng/μL)1 μL,ddH2O 15.8 μL。反應程序為:94℃下預變性4 min;94℃下變性30 s,56℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進行32個循環(huán);最后在72℃下延伸7 min,12℃下保存。將擴增產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送廣州博尚生物技術有限公司進行測序,用Vector NIT Suite 8.0軟件分析測序結果,查找該片段上的SNPs位點。

1.2.4 草魚apoA-I-1基因3'UTR序列分析 采用Vector NIT Suite 8.0軟件和Clustalx 1.83軟件將草魚apoA-I-1基因3'UTR序列與GenBank中已登錄的白鰱(登錄號為HM124749)、稀有鮈鯽(登錄號為EU327775)、花魚骨(登錄號為FJ170104, FJ170105)3種鯉科魚類的apoA-I-1基因3'UTR序列進行分析比較。

1.2.5 采用PCR-RFLP法對SNPs位點進行分型PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切體系為:PCR產(chǎn)物0.20 μg,10×fast digest buffer 0.8 μL,限制性內(nèi)切酶0.3 μL,ddH2O 6 μL。酶切產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(Acr與Bis的質量比為29∶1),以120 V恒壓電泳1.5 h后,用銀染法顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Popgene(Version 3.2)軟件分析基因型頻率和等位基因頻率。由于樣本是同一批繁育且同池養(yǎng)殖,采樣時間也一致,不存在時間、環(huán)境及人工飼養(yǎng)水平的差別,所以在建立模型時不考慮季節(jié)、環(huán)境及人工飼養(yǎng)技術差別,利用SPSS 15.0軟件一般線性模型(General Linear Model,GLM)對SNPs位點基因型與草魚主要生長性狀之間的相關性進行最小二乘分析。統(tǒng)計分析模型為

Yij=μ+Bi+eij,

其中:Yij為某個性狀第i個標記第j個個體的觀測值;μ為試驗觀測所有個體的平均值(即總體平均值);Bi為第i個標記的效應值;eij為對應于觀察值的隨機誤差效應。試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差表示。

2 結果

2.1 草魚apoA-I-1基因cDNA序列及SNPs位點的初步分析

由草魚EST文庫獲得草魚apoA-I-1基因cDNA序列1 291 bp,與GenBank已登錄序列分析比較,該序列含CDS序列774 bp,5'UTR序列177 bp,3'UTR序列346 bp,共編碼257個氨基酸。經(jīng)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)在第792個堿基處(相對于起始密碼子ATG)存在C-T突變,命名為C792T位點;在第851個堿基處(相對于起始密碼子ATG)存在G-A突變,命名為G851A位點(圖1)。

2.2 草魚apoA-I-1基因3'UTR SNPs位點基因型的檢測

采用限制性內(nèi)切酶BseGI對C792T位點進行基因型分型,該314 bp序列存在2個BseGI酶切位點。經(jīng)酶切,CC基因型個體具有173、105、36 bp 3條帶,CT基因型個體具有173、121、105、52、36 bp 5條帶,TT基因型個體具有121、105、52、36 bp 4條帶,較小的片段位于圖譜下方,因電泳時間長,顏色較淡,在此僅標出可鑒別基因型的173 bp和121 bp兩個片段(圖2)。用限制性內(nèi)切酶MspI對G851A位點進行基因型分型,經(jīng)酶切, GG基因型個體具有177、137 bp 2條帶,GA基因型個體具有314、177、137 bp 3條帶,AA基因型

個體只有314 bp 1條帶(圖3)。

圖1 草魚apoA-I-1基因cDNA部分序列及SNPs位點Fig.1 Partical cDNA of apoA-I-1 gene and SNPs sites in grass carp

圖2 草魚apoA-I-1基因C792T位點BseGI酶切電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of C792T site in apoA-I-1 gene demonstrated by BseGI PCR-RFLP in grass carp

圖3 草魚apoa-I-1基因G851A位點MspI酶切電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of G851A site in apoA-I-1 gene demonstrated by MspI PCR-RFLP in grass carp

2.3 草魚apoA-I-1基因3'UTR SNPs位點在群體中的分布

草魚apoA-I-1基因C792T位點和G851A位點3種基因型及其等位基因頻率的統(tǒng)計結果見表1和表2。從表1、表2可見:在該試驗群體中,C792T位點的CT型為優(yōu)勢基因型,等位基因C頻率明顯高于等位基因T,C為優(yōu)勢等位基因;G851A位點的GG型為優(yōu)勢基因型,GG型所占比例是GA型的3.7倍,G為優(yōu)勢等位基因。

表1 草魚apoA-I-1基因3'UTR C792T位點在群體中的基因頻率分布Tab.1 Frequencies of alleles and genotypes of C792T in 3'UTR of apoA-I-1 gene in grass carp population%

表2 草魚apoA-I-1基因3'UTR G851A位點在群體中的基因頻率分布Tab.2 Frequencies of alleles and genotypes of G851A in 3'UTR of apoA-I-1 gene in grass carp population%

2.4 草魚apoA-I-1基因3'UTR SNPs位點與生長性狀的關聯(lián)分析

對兩個SNPs位點不同基因型與草魚4個主要生長性狀的關聯(lián)分析結果見表3。從表3可見: C792T位點TT型個體的4個主要生長性狀均值最高,CT型的體質量和體高值高于CC型個體,T為有利等位基因;G851A位點GG型個體的4個生長性狀均值最高,AA型個體的各項值最小,且GG型個體的體長和頭長與GA型、AA型均存在顯著差異(P＜0.05)。

表3 草魚apoA-I-1基因C792T位點和G851A位點不同基因型與草魚生長性狀的關聯(lián)分析Tab.3 Association of C792T site and G851A site of apoA-I-1 gene polymorphisms with growth traits in grass carp

將兩個多態(tài)位點的不同基因型進行組合,得到6種雙倍型(表4)。從表4可見:D3型個體的4個生長性狀均值最高,D6型個體的4個生長性狀均值最低。其中D3型個體的體長、體高均值顯著高于D4、D6型個體(P＜0.05),D6型個體的體長均值顯著低于D1～D5型個體;D3型個體的頭長均值極顯著高于D4、D6型個體(P＜0.01),D6型個體的頭長均值顯著低于D1型個體(P＜0.05)。

3 討論

SNPs主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,即同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼子單個堿基的變化。常表現(xiàn)為單堿基的轉換、顛換、插入和缺失[5],通常發(fā)生轉換與顛換的SNPs之比為2∶1[6]。本試驗中兩個多態(tài)位點都屬于轉換,且只有兩個等位基因。目前,國內(nèi)外采用SNPs方法對魚類生長方面的研究已有很多報道,Tao等[7]對北極嘉魚Salvelinus alpinus的研究發(fā)現(xiàn),GHRH/PACAP2基因上的SNPs位點與北極嘉魚早期生長速率極顯著相關; Case等[8]對大西洋鱈Gadus morhua和其它海域鱈panⅠ基因的研究結果表明,大西洋鱈panⅠ基因的變異對其生長性狀有著重要的影響;Li等[9]對大口黑鱸Micropterus salmoides IGF-I基因5'非編碼區(qū)進行了研究,結果表明,啟動子區(qū)存在多態(tài)位

點,且與大口黑鱸的生長性狀有相關性。

表4 草魚apoA-I-1基因不同雙倍型與草魚生長性狀的關聯(lián)分析Tab.4 Association of apoA-I-1 gene diplotype with growth traits in grass carp

本研究中,在草魚apoA-I-1基因的3'非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)兩個SNPs位點,其中C792T位點TT型個體的生長性狀優(yōu)于CC型和CT型個體;G851A位點GG型個體的生長性狀優(yōu)于GA型和AA型個體。將草魚、白鰱、稀有鮈鯽和花魚骨4種鯉科魚類apoA-I-1基因3'UTR序列進行比較,發(fā)現(xiàn)C792T位點處存在兩種堿基類型,白鰱和稀有鮈鯽的堿基為C,花魚骨的堿基為T;G851A位點處白鰱、稀有鮈鯽和花魚骨3種魚的堿基類型都為G,推測草魚C966T位點的TT型為突變型,且該突變對草魚的生長有利,而G851A位點的AA型也為突變型,對草魚的生長不利。

魚類的生長性狀屬于數(shù)量性狀,由多個基因控制,不同的SNPs位點間可能存在相互作用,由單倍型構成的雙倍型基因比單個SNPs能提供更多的基因型頻率信息[10]。本試驗中對草魚apoA-I-1基因不同雙倍型個體與草魚的生長性狀進行關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)D3型(TTC792T-GGG851A)個體的體質量、體長和體高均值最高,D6型(CCC792TAAG851A)個體的體質量、體長和體高均值最低,可見D3型是有利基因型。由此可見,當兩個位點都為有利基因型時,其生長性狀均值最高;當兩個多態(tài)位點中存在一個有利基因型或者兩個位點都為不利基因型時,其生長性狀均值最低。C792T位點的T為有利等位基因,且在群體中所占的比例不高,在草魚的分子輔助育種中具有較大的選擇潛力。在選育時可以考慮以apoA-I-1基因作為候選基因,應用于草魚的分子輔助育種,選擇C792T位點為TT型以及G851A為GG型的個體,淘汰G851A位點為AA型的個體。

目前對基因表達調(diào)控的研究主要集中在基因的5'端,其實3'端序列亦含有豐富的信息量,基因的3'非翻譯區(qū)涉及了基因轉錄后水平的調(diào)控過程,主要參與mRNA的穩(wěn)定性及降解速率、翻譯時間和位點、控制翻譯起始及效率等[11-14]。有關魚類apoA-I-1基因的3'UTR調(diào)控元件的研究還很少,其區(qū)域堿基突變而引起生長性狀改變的作用機理尚不清楚,還有待深入研究。

本研究中對草魚apoA-I-1基因cDNA序列進行了分析,并在3'UTR發(fā)現(xiàn)了兩個SNPs位點,通過一般線性模型分析,了解到這些突變位點不同基因型與草魚的生長性狀存在著一定的關聯(lián),這將有利于解決草魚性成熟周期長等問題,并為培育出草魚的優(yōu)良品系提供參考資料。

[1] 尹紹武,黃海,雷從改,等.DNA標記技術在魚類遺傳育種中的應用[J].水產(chǎn)科學,2005,24(11):42-45.

[2] Amthauer R,Villanueva J,Vera M,et al.Characterisation of the major plasma apolipoproteins of the high density lipoprotein in the carp(Cyprinus carpio)[J].Comparative Biochemistry&Physiology,1989,92B:787-793.

[3] Concha M I,Smith V J,Castro K,et al.Apolipoproteins A-I and A -II are potentially important effectors of innate immunity in the teleost fish Cyprinus carpio[J].Eur J Biochem,2004,271:2984-2990.

[4] Villarroel F,Bastías A,Casado A,et al.Apolipoprotein A-I,an antimicrobial protein in Oncorhynchus mykiss:evaluation of its expression in primary defense barriers and plasma levels in sick and healthy fish[J].Fish&Shellfish Immunol,2007,23:197-209.

[5] Alain V,Denis M,Magali S C,et al.A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics[J]. Genet Sel Evol,2002,34:275-305.

[6] Brookes A J.The essence of SNPs[J].Gene,1999,234:177-186.

[7] Tao W J,Boulding E G.Association between single nucleotide polymorphisms in candidate genes and growth rate in Arctic charr (Salvelinus alpinus L.)[J].Heredity,2003,91:60-69.

[8] Case R A J,Hutchinson W F.Association between growth and Pan I genotype within Atlantic cod full-sibling families[J].American Fisheries Society,2006,135:241-250.

[9] Li Xiaohui,Bai Junjie,Ye Xing,et al.Polymorphisms in the 5'flanking region of the insulin-like growth factor I gene are associated with growth traits in large mouth bass Micropterus salmoides [J].Fisheries Science,2009,75(2):351-358.

[10] Stephens M,Smith N,Donnelly P.A new statistical method for haplotype reconstruction from population data[J].Am J Hum Genet,2001,68:978-989.

[11] 江元清,凌毅,趙武玲.真核mRNA的3'非翻譯區(qū)轉錄調(diào)控作用研究進展[J].植物學通報,2001,18(1):3-10.

[12] Xie X H,Lu J,Kulbokas E J,et al.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3'-UTRs by comparison of several mammals[J].Nature,2005,434:338-345.

[13] Wilkie G S,Dickson K S,Gray N K.Regulation of mRNA translation by 5'-and 3'-UTR binding factors[J].Trends in Biochemical Sciences,2003,28(4):182-188.

[14] 陳淑華.真核生物mRNA 3'-非翻譯區(qū)的調(diào)控功能[J].國外醫(yī)學:生理、病理科學與臨床分冊,2003,23(12):611-614.

SNPs screening of 3'UTR in Apoprotein A-I-1 gene and its association with growth traits in grass carp

LIU Xiao-xian1,2,BAI Jun-jie2,YU Ling-yun2,LI Sheng-jie2
(1.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Key Laboratory of Tropical&Subtropical Fishery Resource Application&Cultivation,Ministry of Agriculture,Pearl River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510380,China)

Screening and genotype SNPs in 3'UTR of Apoprotein A-I-1 gene were conducted in grass carp(Ctenopharyngodon idellus)through PCR sequencing and PCR-RFLP method from EST database.Two SNPs(C792T and G851A)were obtained in the cultured population of grass carp from Pearl River.The CC genotype in C792T site was found 46.53%,CT genotype 50.69%,and TT genotype 2.78%.The GG genotype in G851A was found 77.08%,GA genotype 20.83%,and AA genotype 2.08%.A general linear model was used to analyze associations of apoA-I-1 gene with 4 major growth traits(body weight,body length,body height and head length).The results showed that the mean body weight of BB genotype was higher than that of CC and CT genotype in C792T site (P＞0.05).The mean weight,body length,body height and head length of GG genotype in G851A was higher than GA and AA genotype(P＜0.05).Six diplotypes were constructed based on two SNPs in the experimental population.The mean body weight of diplotype D3(TTC792T-GGG851A)was higher than other diplotypes.The diplotype D6 (CCC792T-AAG851A)had the minimal mean body weight,and had significant differences in body length,body height and head length(P＜0.05).TT genotype in C792T site was advantage genotype.GG genotype in G851A site was advantage genotype,and AA genotype disadvantage genotype.It is suggested that apoA-I-1 gene be a candidate modifier gene for grass carp growth traits,indicating that the apoA-I-1 gene could be useful for grass carp molecular breeding.

grass carp;SNP;Apoprotein A-I-1;apoA-I-1;growth trait;diplotype;association analysis

Q789

A

2095-1388(2012)01-0012-06

2011-04-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助項目(CARS-46-03);國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2011AA100403);國家科技支撐計劃項目(2012BAD26B02)

劉小獻(1986-),女,碩士研究生。E-mail:littlebearliu@126.com

白俊杰(1957-),男,研究員。E-mail:jjbai@163.net