馮成利， 項 琪， 張齊好， 楊 艷， 柯 實， 黃亞東，， 蘇志堅，△

(1陜西省動物研究所，陜西西安710032;暨南大學2廣東省生物工程藥物重點實驗室，3基因工程藥物國家工程研究中心，廣東廣州510632)

人角質(zhì)細胞生長因子(human keratinocyte growth factor，hKGF)屬于成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)超家族，是一種具有刺激胚胎發(fā)育、促進上皮細胞增殖和遷移及調(diào)節(jié)機體免疫等重要生物學功能的細胞生長因子［1－2］。hKGF由間質(zhì)細胞所產(chǎn)生，以旁分泌方式特異性作用于上皮細胞［3］。與其它能與肝素結(jié)合的成纖維細胞生長因子不同的是，hKGF對成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及黑色素細胞沒有促增殖作用［2－3］。大量的研究表明，hKGF是FGFs家族中對皮膚角質(zhì)形成細胞最有效的促細胞分裂因子，其通過刺激傷口重新上皮化、增厚表皮及激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號通道抑制細胞凋亡來預防和修復［4］。因此，現(xiàn)時hKGF已廣泛應(yīng)用于角膜損傷修復和皮膚創(chuàng)傷愈合，并在肺損傷修復、胃腸道修復、構(gòu)建人工皮膚和輻射防護等方面具有潛在臨床應(yīng)用前景［5－6］。鑒于hKGF在臨床應(yīng)用上的多用途和重要性，因此利用基因工程方法大量制備，不僅有利于深入研究它的生物學功能，還能滿足其在臨床中的需要。到目前為止，科研人員已經(jīng)利用大腸桿菌、植物及哺乳動物細胞中表達hKGF，但低表達量、沒有充分糖基化或生產(chǎn)成本高昂使得hKGF規(guī)模化生產(chǎn)難以實現(xiàn)［7－11］。本研究以酵母表達偏好的密碼子為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成編碼hKGF成熟肽的DNA序列，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中表達并優(yōu)化宿主高密度發(fā)酵條件，高效表達具糖基化修飾的重組hKGF。

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒 分泌型表達載體pPICZαA購自Invitrogen，Pichia pastoris菌株X－33和大腸桿菌TOP10F'菌株均為本實驗室保存。

1.2 酶和試劑 各種限制性內(nèi)切酶(SacⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ)、T4 DNA連接酶及高保真Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司;DNA膠回收試劑盒、PCR片段純化試劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海申能博彩生物工程有限公司;hKGF抗體購自Abcam(Cat:ab9598);離子交換層析凝膠和肝素親和層析凝膠購自安瑪西亞公司;恒河猴肺上皮細胞株4MBr－5購自美國組織培養(yǎng)庫(American Tissue Culture ColLection，ATCC;Cat:CCL－208);hKGF標準品購自Sigma－Aldrich(Cat:H6666)。用于擴增的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;其余常用試劑均為市售國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中獲得hKGF核苷酸序列(No.NM_002009)，然后利用Lasergene PrimerSelect 7.1(DNAStar Inc.)，按照畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計出14條引物，見表1。通過PCR搭橋方法(圖1)，最終獲得編碼全長hKGF蛋白的DNA片段［12］。將該片段克隆至分泌表達載體pPICZαA中，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA－h(huán)KGF。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10F'中，25 mg/L Zeocin(Invitrogen;Cat:R250－01)抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑選重組子接種到新鮮Luria－Bertani(LB)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)14～16 h后，離心收集菌體并抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

材料和方法

表1 用于人工合成編碼hKGF的PCR引物Table 1 .PCR primers used to construct the synthetic hKGF gene

Figure 1.PCR strategy for synthesis of DNA encoding hKGF.F and R mean forward and reverse primer pairs，respectively.L means the length of PCR primer.圖1 編碼hKGF DNA片段的PCR人工合成策略

2.2 酵母轉(zhuǎn)化和重組子的篩選 提取10 μg經(jīng)測序正確的pPICZαA－h(huán)KGF重組質(zhì)粒，用SacⅠ進行單酶切后回收。然后，按說明書規(guī)程將酵母菌X－33制成感受態(tài)菌，在25 μF、1.5 kV、400 Ω條件下電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在終濃度為100 mg/L Zeocin抗性、含山梨醇的酵母浸出蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium containing sorbitol，YPDS)瓊脂平板上，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落，接種到新鮮酵母浸出蛋白胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，然后13 500×g離心收集菌體，并用引物F8和R4進行菌落PCR鑒定，篩選出整合有目的基因的重組子。將重組子接種到培養(yǎng)基中并按說明書制成感受態(tài)，然后按上述方法反復電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒，高抗性Zeocin (1 g/L)篩選重組子，從而獲得含高拷貝目的基因的重組表達菌株。

2.3 表達菌株的篩選和誘導表達 挑取上述經(jīng)鑒定的重組轉(zhuǎn)化子，分別接種到5 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至A600=4～6。然后按5%的比例轉(zhuǎn)接到10 mL復合甘油緩沖液體培養(yǎng)基(buffered glycerol－complex medium，BMGY)中，于30℃、250 r/min培養(yǎng)16～24 h。在無菌條件下，6 000×g離心10 min收集菌體，棄上清，加入10 mL復合甲醇緩沖液體培養(yǎng)基(buffered methanol－complex medium，BMMY)誘導培養(yǎng)基重懸菌體，250 r/min培養(yǎng)60 h。每20 h取樣，進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)并用薄層凝膠掃描分析。

2.4 重組表達菌高密度發(fā)酵 將篩選出來的重組子接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)16～18 h，然后按2%比例接種至200 mL BMGY中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至A600= 4～6后，再按10%比例轉(zhuǎn)接到2 L無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中［9］。發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為:溶氧含量為20%～50%，pH 6.0，通氣量10 L/min，溫度為28℃。在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～22 h后按照12.5 mL·h－1·L－1速度流加50%甘油溶液8 h，然后以6 mL·h－1·L－1速度流加1 h，再按3 mL·h－1·L－1速度流加1 h后，饑餓培養(yǎng)0.5 h。在調(diào)整流加甘油溶液的2 h內(nèi)，同時逐步調(diào)整發(fā)酵溫度至20℃。待溶氧指數(shù)穩(wěn)定后，開始流加100%甲醇進行誘導，流速設(shè)定為1～12 mL·h－1· L－1，誘導時間為60 h，期間同時流加10%葡萄糖溶液及5%磷酸銨溶液，直至發(fā)酵結(jié)束。離心收集發(fā)酵上清并用12% SDS－PAGE凝膠電泳檢測。

2.5 重組蛋白的分離純化 將發(fā)酵液在4℃、13 500×g離心20 min，收集上清，然后用截留分子量為5 kD的超濾膜包(Millipore;Cat:U650600)進行濃縮，同時加入0.02 mol/L磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB，pH 7.4)調(diào)整pH至7.4。用肝素交換層析凝膠裝填層析柱，用5倍柱床體積含0.05 mol/L NaCl及0.02 mol/L PB(pH 7.4)的結(jié)合緩沖液以流速8 cm/h平衡。將濃縮后的發(fā)酵液以6 cm/h速度上樣，然后用大量的結(jié)合緩沖液洗柱。最后，分別用含0.3 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl、1.0 mol/L NaCl和2.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L PB(pH 7.4)進行洗脫。收集洗脫液并進行SDS－PAGE凝膠電泳檢測。

2.6 重組hKGF活性測定 用含10%胎牛血清的Ham's F－12K培養(yǎng)基(Sigma－Adlrich;Cat:N6908)培養(yǎng)4MBr－5細胞至對數(shù)生長期，然后用0.25%(W/V)的胰蛋白酶溶液消化并計數(shù)，按每孔7 000個細胞加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，換入含2%血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。用培養(yǎng)基將純化后的重組蛋白及商品化hKGF進行系列稀釋后，加入到細胞培養(yǎng)板中(100 μL/ well)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。棄上清，加入二甲基亞砜100 μL，室溫放置30 min后，用酶聯(lián)免疫比色儀測定其吸光度，測定波長為570 nm，對照波長為630 nm。

結(jié)果

1 重組hKGF基因序列的改造及合成

按照畢赤酵母偏好密碼子合成14條引物(表1)，采用PCR搭橋方法(圖1)，獲得長度約為530 bp編碼hKGF蛋白的DNA片段，見圖2。將該片段克隆至畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA中，獲得重組表達質(zhì)粒pPICZαA－h(huán)KGF。Xba I和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒結(jié)果表明，合成編碼hKGF的DNA片段大小與預期的一致，見圖3。此外，測序結(jié)果也表明hKGF序列與預期是一致的(結(jié)果未顯示)。

Figure 2.Electrophoresis analysis of the final PCR product.Lane 1:PCR product;M:DNA marker.圖2 PCR擴增終產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

Figure 3.Recombinant plasmids digested by restricted endonucleases.Lane 1:XhoⅠ;Lane 2:Xba I;Lane 3:XhoⅠand XbaⅠ;M:DNA marker.圖3 限制性內(nèi)切酶消化重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳分析

2 重組酵母的獲得和鑒定

通過電擊法將線性化的pPICZαA－h(huán)KGF轉(zhuǎn)化入宿主菌X－33中，經(jīng)抗生素梯度篩選后獲得高抗性表達株，挑取單克隆并振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集菌體，提取酵母基因組DNA，以F8和R4作為引物進行PCR鑒定，電泳結(jié)果表明，重組表達載體pPICZαA－h(huán)KGF成功整合入酵母基因組中，見圖4。

Figure 4.Identification of transformants by PCR.Lane 1～5:transformants;Lane 6:control strain;M:DNA marker.圖4 PCR方法鑒定重組轉(zhuǎn)化子

3 重組hKGF在酵母中的表達

重組酵母經(jīng)搖瓶發(fā)酵60 h后，取上清液進行 SDSPAGE凝膠電泳，結(jié)果顯示，重組菌能表達分子量約為28 kD的hKGF，與預期一致，而表達量約占上清總蛋白量的8%左右。通過優(yōu)化條件后進行高密度發(fā)酵，結(jié)果表明，隨著誘導時間的延長，重組蛋白的表達量也不斷增加，發(fā)酵結(jié)束時，hKFG的表達量約占上清總蛋白量的14.1%，見圖5、6。

4 重組hKGF的分離純化

發(fā)酵液經(jīng)超濾、肝素親和層析及分子篩Sephardex G－25分離純化后，收集洗脫液并進行SDS－PAGE電泳及薄層凝膠掃描分析。銀染結(jié)果顯示，重組蛋白的純度達到95.0%以上，見圖7，且能與hKGF單克隆抗體產(chǎn)生陽性反應(yīng)，見圖8。此外，重組蛋白還通過高效液相色譜及氨基酸N端測序鑒定其準確性，表明其與天然蛋白序列一致(資料未顯示)。hKGF分離純化的步驟以及得率如表2所示。

Figure 5.SDS－PAGE analysis of the expression of secretory recombinant hKGF.Lane 1～4:four individual transformants;M:protein marker.The arrow indicates hKGF (28kD).圖5 重組hKGF的SDS－PAGE分析

Figure 6.SDS－PAGE analysis of recombinant hKGF expression in P.pastoris after fermentation.Recombinant yeast was grown in a high－density fermentor and hKGF was induced by methanol for 20 h(Lane 1)，40 h(Lane 2)and 60 h(Lane 3).M:protein marker.The arrow indicates hKGF(28 kD).圖6 優(yōu)化條件后重組hKGF表達的凝膠電泳分析

Figure 7.SDS－PAGE analysis of recombinant hKGF(sliver staining).Lane I recombinant hKGF;M:protein marker.圖7 純化后重組hKGF的凝膠電泳檢測

Figure 8.Western blotting analysis of purified recombinant hKGF.Lane 1:hKGF;Lane 2:control.圖8 純化后重組hKGF的Western blotting檢測

表2 重組hKGF分離純化步驟及得率總結(jié)Table 2 .Summary of the purification of hKGF expressed in P.pastoris by fermentation

5 重組hKGF蛋白的活性測定

MTT結(jié)果表明，重組hKGF具有顯著的促恒河猴肺上皮細胞增殖作用，并且呈濃度劑量依賴性，其 ED50約為57 μg/L，與標準品相比沒有顯著差異，見圖9。

Figure 9.Pro－proliferative activeity of recombinant hKGF expressed in P.pastoris and commercial product for 4MBr－5 cells.±s.n=3.圖9 重組hKGF對4MBr－5細胞促增殖活性的檢測

討論

hKGF具有廣泛的生物學活性，可促進多種組織和器官上皮細胞的增殖與分化，是迄今為止對角質(zhì)形成細胞最有效的促細胞分裂因子，目前已被廣泛用于治療角膜和皮膚創(chuàng)傷以及輻射防護等方面。

成熟的野生型hKGF為163個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對分子質(zhì)量約為28 kD，具有糖基化修飾［2］。有研究表明，沒有糖基化hKGF促細胞有絲分裂的活性顯著高于糖基化hKGF［7，9］，而我們的細胞活性測定結(jié)果也驗證了這個結(jié)論。在本研究中獲得的酵母表達重組hKGF的ED50約為57 μg/L，而商品化大腸桿菌表達重組hKGF的ED50一般為5～10 μg/L。目前，對于糖基化修飾影響hKGF生物活性的作用機理尚未明確，然而，結(jié)構(gòu)生物學研究結(jié)果顯示，糖基化修飾可能影響hKGF與上皮細胞膜受體結(jié)合能力［13］。在另一方面，糖基化修飾對hKGF結(jié)構(gòu)完整性可能也有保護作用。本研究在分離純化過程中發(fā)現(xiàn)，相對于原核表達的重組hKGF，糖基化hKGF不容易發(fā)生降解(資料未顯示)。

迄今為止，已有研究利用基因工程方法在真核系統(tǒng)中表達糖基化的重組hKGF，表達量從微克級到1.1 mg/L［10－11，13］。有意思的是，在轉(zhuǎn)基因植物中表達的KGF的表觀分子量約為19～20 kD，似乎沒有糖基化修飾或者糖基化不充分［10－11］。在本研究中，最終重組hKGF的產(chǎn)量達到12 mg/L，且具有糖基化修飾，可以滿足實驗的需求，但相對于工業(yè)化，仍有很大的差距。王希菊等［9］利用畢赤酵母表達不含糖基化位點的截斷型hKGF，其純化后產(chǎn)量可以達到50 mg/L，因此，我們推測蛋白糖基化的修飾過程可能是影響hKGF產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

總的來說，本研究合成畢赤酵母偏好密碼子的hKGF基因并轉(zhuǎn)化畢赤酵母中進行表達。利用肝素親和層析和Sephardex G－25分子篩聯(lián)用獲得純度為95%以上的重組蛋白，得率為12 mg/L。重組蛋白具有糖基化修飾，且能顯著促進恒河猴肺上皮細胞增殖。這些結(jié)果可為日后重組hKGF的開發(fā)應(yīng)用打下一定基礎(chǔ)。

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