林運(yùn)靈， 李維維， 陳良龍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建福州350001)

老齡是心肌梗死后不良事件發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測因素［1－2］。在成功接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后，70歲以上心肌梗死患者發(fā)生心室重塑、心力衰竭的比例較70歲以下人群增高［3］。老齡使得心肌損傷后修復(fù)機(jī)制受損，從而導(dǎo)致加劇心梗后心室重塑、心功能惡化，但其具體機(jī)制仍未明確。與成年大鼠相比，老齡大鼠心梗后肉芽組織生長緩慢，瘢痕組織中膠原含量明顯下降［4］。在心梗面積可比的情況下，與青年小鼠相比，老齡小鼠心肌梗死區(qū)域中肌成纖維細(xì)胞密度顯著降低，膠原含量減少，導(dǎo)致瘢痕組織強(qiáng)度減弱，梗死區(qū)域擴(kuò)展，心功能受損更為嚴(yán)重［4］。在老齡動物中，損傷修復(fù)過程中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化發(fā)生障礙，但其具體機(jī)制仍未闡明。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)通過Smad及非Smad信號通路參與器官損傷后的修復(fù)過程。TGF－β1在心肌梗死后大量表達(dá)，是激活成纖維細(xì)胞最關(guān)鍵的分子［5］;研究顯示，老齡小鼠心肌成纖維細(xì)胞TGF－β1/Smad信號通路受損;但老齡對心肌成纖維細(xì)胞TGF－β1的非Smad信號通路是否有影響，目前尚不清楚。本研究觀察老齡大鼠成纖維細(xì)胞對TGF－β1作用后p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)和c－Jun氨基端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)磷酸化水平的變化，探討老齡對大鼠心肌成纖維細(xì)胞TGF－β1的非Smad信號通路的影響。

材料和方法

1 動物與主要試劑

健康雄性Sprague－Dawley(SD)乳鼠(3 d)及老齡(24月齡)大鼠，清潔級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。DMEM培養(yǎng)基、膠原蛋白酶和MTT購自Sigma。胎牛血清購自HyClone。抗波形蛋白抗體、α－平滑肌肌動蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)購自Abcam。Phospho－p38、phospho－JNK購自CST。

2 方法

2.1 大鼠心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng) SD大鼠斷頸處死后，常規(guī)消毒胸腹部皮膚，暴露出心臟，沿心臟根部剪下心臟，放入含肝素的PBS中洗凈血液，去除心房和殘留的主動脈。將心臟移至消化管中，剪碎，加入II型膠原酶消化液10 mL，37℃水浴中消化20 min，自然沉淀后棄去上清。再加入上述酶消化液10 mL，在37℃水浴中消化后，小心吸取上清，用含5%FBS的DMEM中和膠原酶，200×g離心7 min，沉淀用DMEM懸浮后4℃保存。重復(fù)上述消化過程直至組織塊完全被消化。DMEM懸浮的細(xì)胞經(jīng)200×g離心7 min后以含15% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM懸浮，經(jīng)細(xì)胞篩過濾后，放入CO2培養(yǎng)箱中靜置2 h使心臟成纖維細(xì)胞貼壁。生長近融合時(shí)以1∶3傳代，實(shí)驗(yàn)采用第3代細(xì)胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)24 h后進(jìn)行干預(yù)［6］。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為乳鼠PBS對照組(N1組)，加入等體積的PBS;乳鼠TGF－β1干預(yù)組(N2組)，加入TGF－β1(5 μg/L);老齡鼠PBS對照組(A1組)，加入等體積的PBS;老齡鼠TGF－β1干預(yù)組(A2組)，加入TGF－β1(5 μg/L)。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 心肌成纖維細(xì)胞終止培養(yǎng)，漂洗后4%多聚甲醛固定，室溫下30 min，PBS沖洗3次，每次5 min;滴加0.3%Triton－X 100，室溫下8 min，PBS沖洗3次，每次5 min;滴加3%H2O2溶液，室溫下10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次5 min;滴加Ⅰ抗抗波形蛋白肌動蛋白、肌動蛋白，4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，每次5 min;滴加羊抗鼠IgG抗體－HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min;DAB顯色10～15 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。每組染色均設(shè)有陰性對照，以0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。2.4 MTT法測定細(xì)胞增殖活力 取對數(shù)生長期心肌成纖維細(xì)胞5×103cells/well的密度接種于96孔板中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后換無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄各孔培養(yǎng)基，隨后分組再培養(yǎng)24 h。各組于藥物刺激結(jié)束前4 h，吸棄上清，加入MTT 20 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm處測定吸光度。

2.5 Western blotting檢測心肌成纖維細(xì)胞p38和JNK蛋白磷酸化水平 每孔中均加入200 μL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%NP－40，0.5%sodium deoxycholate，0.1% SDS，100 mg/L PMSF，2 mg/L aprotinin)，置于冰上充分裂解，用刮棒將細(xì)胞刮下，然后將細(xì)胞碎片和裂解液移至0.6 mL離心管中。加入等體積的2×SDS (臨用前加入5×DTT液)，超聲振蕩5 min，立即放入水浴鍋中100℃煮10 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。上清液中蛋白濃度以BCA法測定。取等量蛋白(50 μg/well)，經(jīng)SDS－PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉，加入1∶500稀釋的Ⅰ抗，4℃過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗檢測目標(biāo)蛋白。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，X線膠片壓片、顯影、定影，圖像分析系統(tǒng)測定目的條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶的吸光面積積分比值來評定其蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，多組結(jié)果比較采用單因素方差分析及Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)觀察及鑒定

在倒置顯微鏡下觀察，心肌成纖維細(xì)胞呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核明顯大，呈橢圓形，常含有2～3個(gè)核(圖1A)。細(xì)胞抗波形蛋白染色陽性，平滑肌肌動蛋白陰性，符合心肌成纖維細(xì)胞染色特征(圖1B、C)。

Figure 1.Morphological observation and identification of cardiac fibroblasts(×200).A:morphology of cardiac fibroblasts under phase－contrast microscope;B:immunocytochemical staining for vimentin in cardiac fibroblasts;C:immunocytochemical staining for actin in cardiac fibroblasts.圖1 心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

2 各組細(xì)胞增殖對比

在無TGF－β1刺激時(shí)，N1組與A1組平均吸光度無顯著差異(0.36±0.04 vs 0.32±0.03，n=6，P＞0.05);在加入TGF－β1后，A2組平均吸光度較N2組顯著減低(0.54±0.06 vs 0.44±0.05，n=6，P＜0.05)，提示在TGF－β1作用下，老齡組心肌成纖維細(xì)胞增殖能力下降。

3 各組總p38及磷酸化p38的表達(dá)水平

Western blotting顯示，各組總p38蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異;加入TGF－β1后，N2組的磷酸化p38較N1組明顯升高(0.80±0.12 vs 0.18±0.03，n= 6，P＜0.05);A2組的磷酸化p38較A1組明顯升高(0.42±0.14 vs 0.16±0.05，n=6，P＜0.05);與N2組相比，A2組磷酸化 p38表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)，見圖2。

4 各組總JNK及磷酸化JNK的表達(dá)水平

Western blotting顯示，各組總JNK蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異;加入TGF－β1后，N2組的磷酸化JNK較N1組明顯升高(0.93±0.21 vs 0.06±0.02，n=6，P＜0.05);A2組的磷酸化JNK較A1組明顯升高(0.54±0.16 vs 0.05±0.01，n=6，P＜0.05);與N2組相比，A2組磷酸化JNK表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)，見圖3。

討論

Figure 2.Expression of total p38 and phospho－p38 in cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.N1:neonatal cardiac fibroblasts;N2:neonatal cardiac fibroblasts treated with TGF－β1;A1:aged cardiac fibroblasts;A2: aged cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.圖2 各組總p38及磷酸化p38的表達(dá)水平

Figure 3.Expression of total JNK and phospho－JNK in cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.N1:neonatal cardiac fibroblasts;N2:neonatal cardiac fibroblasts treated with TGF－β1;A1:aged cardiac fibroblasts;A2:aged cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.圖3 各組總JNK及磷酸化JNK的表達(dá)水平

心肌成纖維細(xì)胞是心臟中數(shù)量最多的間質(zhì)細(xì)胞，占心臟非心肌細(xì)胞的90%～95%，也是心臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的主要分泌細(xì)胞，在維持正常心臟的ECM中具有非常重要的作用，還是病理性心肌纖維化和心室重塑的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子［7－8］。成纖維細(xì)胞是組織損傷修復(fù)的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，在正常情況下心肌成纖維細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，急性心肌梗死后，靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力及細(xì)胞因子如TGF－β1、血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)、內(nèi)皮素(endothelin，ET)、白細(xì)胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)等病理因素的作用下發(fā)生活化，激活后的成纖維細(xì)胞(即肌成纖維細(xì)胞)遷移到心梗區(qū)域，表達(dá)α－平滑肌肌動蛋白，分泌炎癥因子、趨化因子、生長因子等，啟動損傷后心肌修復(fù)過程［5，9］。老齡導(dǎo)致組織損傷后愈合能力下降。與青年人相比，老齡患者傷口愈合速度緩慢［10－11］;老齡動物在創(chuàng)傷愈合過程中對外源性生長因子反應(yīng)低下［12］。TGF－β1是最重要的促纖維化生長因子，可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，為諸多因素所致心肌纖維化的共同通路。

TGF－β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括Smad及非Smad信號通路兩類［13－14］。TGF－β1通過 Smad與非 Smad信號通路(包括p38和JNK)，參與心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的活化過程，活化的肌成纖維細(xì)胞分泌膠原，參與心肌纖維化過程［15］。MAPK信號通路是TGF－β1非Smad信號通路中最重要的。既往研究顯示，老齡導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞增殖能力［16］及遷移能力減弱［17］。與青年大鼠相比，老齡大鼠心梗后TGF－β1的含量并沒有顯著變化，然而，老齡大鼠成纖維細(xì)胞對TGF－β1反應(yīng)低下，可能與Smad蛋白磷酸化水平減弱導(dǎo)致 TGF－β1/Smad通路受損有關(guān)［4］。本研究結(jié)果顯示，在接受TGF－β1刺激后，老齡大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖能力下降;無論是新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞還是老齡大鼠心肌成纖維細(xì)胞的p38及JNK磷酸化水平均明顯升高，提示TGF－β1可能同時(shí)激活心肌成纖維細(xì)胞中的p38及JNK信號通路;本研究同時(shí)觀察到，老齡組心肌成纖維細(xì)胞的p38及JNK磷酸化水平均較幼鼠組下降，提示老齡不僅使TGF－β1/Smad通路受損，同樣使得心肌成纖維細(xì)胞的TGF－β1/MAPK信號通路相關(guān)蛋白功能受損。

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